全基因组甲基化测序文库及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及高通量测序文库构建领域，具体而言，设及一种全基因组甲基化测序 文库及其构建方法。
【背景技术】
[0002] DNA甲基化是基因组DNA的一种主要表观遗传修饰形式。近年来，大量研究表明 DNA甲基化修饰对于维持正常细胞功能、传递基因组遗传印记、胚胎发育W及人类肿瘤发 生，起着至关重要的作用。甲基化研究成了表观遗传学的热点，相应的技术也是层出不穷， 根据实验目的的不同，该些技术大体能够分成两类；全基因组甲基化研究技术W及特异性 甲基化位点研究技术。
[000引WGBS(Wholegenomebisulfitesequencing)，即全基因组重亚硫酸盐测序。实验 原理是；前期用重亚硫酸处理，将基因组中未发生甲基化的C碱基转化成U，进行PCR扩增 后变成T，与原本具有甲基化修饰的C碱基区分开来；W第二代高通量测序平台为基础，结 合全基因组重亚硫酸处理和生物信息数据分析技术，进行低成本、高效率、高准确度的全基 因组DNA甲基化水平图谱绘制。
[0004] 随着二代测序的飞速发展，测序成本大幅度下降，WGBS技术可W绘制单碱基分辨 率的全基因组DNA甲基化图谱，对于研究来讲具有绝对的技术优势。从巧片到第二代高通 量测序，从特异性甲基化位点到全基因组甲基化研究，相应的技术也是层出不穷。测序成本 大幅度下降使得甲基化组（methylome)的研究成为可能。目前，基于第二代测序平台的基 因组甲基化研究，主要包括WGBS、RRBS和MeDIPS种技术，如下表1所示，对于不同的甲基 化区域，可W选择不同的技术来实现：
[0005] 提到甲基化测序，首先想到的必然是"金标准"全基因组重亚硫酸盐测序（whole genomebisulfitesequencing),简称BS-seq。该方法的实验原理是前期用Bisulfite处 理，将基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U，进行PCR扩增后变成T，与原本具有甲基化 修饰的C碱基区分开来，再结合高通量测序技术，特别适用于绘制单碱基分辨率的全基因 组DNA甲基化图谱。WGBS技术可W绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱，对于研 究来讲具有绝对的技术优势。
[0006] 到目前为止，全基因组重亚硫酸盐测序是DNA甲基化研究比较好的方法，但是该 方法本身存在设计缺陷，导致生物信息学分析时会降低甲基化程度评估的准确性，阻碍了 其应用，因而，仍需要对现有的全基因组甲基化测序方法进行改进，W提高后续甲基化程度 评估的准确性。
[0007]表1 ;
[000引
【主权项】
1. 一种全基因组甲基化测序文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括w下步 骤： S1，对所述全基因组DNA进行片段化，得到DNA片段； 52, 采用dATP、dTTP和dGTP混合形成的dNTP对所述DNA片段进行末端修复，得到修复 片段； 53, 对所述修复片段进行3'末端加"A"，得到3'末端带"A"片段； 54, 采用经过"C"到"T"转化处理的接头序列对所述3'末端带"A"片段进行接头连接， 得到带接头的片段； 55, 对所述带接头片段进行"C"到"T"转化处理，得到处理片段； S6，对所述处理片段进行扩增，得到所述全基因组甲基化测序文库。
2. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在所述步骤S1之后，W及所述步骤 S2之前，所述构建方法还包括对所述DNA片段进行纯化的步骤。
3. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述纯化的步骤采用DNA亲和柱进行 纯化。
4. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述纯化的步骤采用QIAquick PCR 纯化试剂盒中的所述DM亲和柱对所述DM片段进行纯化。
5. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在所述步骤S2中，采用化d-It试剂 盒中的dATP、dTTP和dGTP混合形成的dNTP对所述DNA进行末端修复，得到所述修复片段。
6. 根据权利要求1或5所述的构建方法，其特征在于，在所述步骤S2之后，W及所述步 骤S3之前，所述构建方法还包括对所述修复片段进行纯化的步骤。
7. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在所述步骤S3之后，W及所述步骤 S4之前，还包括采用Ampure XP磁珠对所述3'末端带"A"片段进行纯化的步骤。
8. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在所述步骤S4之后，W及所述步骤 S5之前，所述构建方法还包括对所述带接头片段进行定量的步骤。
9. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在所述步骤S5中，采用EZ DNA Methylation-Li曲tning?试剂盒对所述带接头片段进行"C"到"T"转化处理，得到所述处 理片段。
10. -种全基因组甲基化测序文库，其特征在于，采用权利要求1至9中任一项所述的 构建方法构建而成。
【专利摘要】本发明提供了一种全基因组甲基化测序文库及其构建方法。该构建方法包括以下步骤：S1，对全基因组DNA进行片段化，得到DNA片段；S2，采用由dATP、dTTP和dGTP混合形成的dNTP对DNA片段进行末端修复，得到修复片段；S3，对修复片段进行3’末端加“A”，得到3’末端带“A”片段；S4，采用经过“C”到“T”转化处理的接头序列对3’末端带“A”片段进行接头连接，得到带接头片段；S5，对带接头片段进行“C”到“T”转化处理，得到处理片段；S6，对处理片段进行扩增，得到全基因组甲基化测序文库。通过采用不含dCTP的dNTP进行末端修复，避免了非甲基化C的引入，提高了甲基化程度分析的准确性。
【IPC分类】C12Q1-68, C40B40-06, C40B50-06
【公开号】CN104532360
【申请号】CN201410788846
【发明人】王苗英, 朱海浩, 蒋智, 李明洲, 王大伟, 刘运超, 曹志生
【申请人】北京诺禾致源生物信息科技有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月17日