胸腺素α1的固相片段合成方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多肽药物化学合成领域，具体涉及一种胸腺素a1的固相片段合成方 法。
【背景技术】
[0002] 胸腺素是由胸腺分泌的一种重要的多肽类免疫调节因子，具有显著增强免疫功 能的作用，被公认为特异性调节免疫失衡状态及增强免疫力最有效的药物。胸腺素^最初 是从小牛胸腺中提取出来的。胸腺素％由28个氨基酸残基组成，分子量为3108,等电点为 4. 2，N端含有乙酰化结构。胸腺素B1通过刺激外周血液淋巴细胞丝裂原来促进T淋巴细 胞的成熟，增加抗原或丝裂原激活后T细胞分泌的干扰素a、干扰素Y以及白介素2、白介 素3等淋巴因子水平，同时增加T细胞表面淋巴因子受体水平。化学合成的胸腺素(商 品名为日达仙）已用于慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、恶性黑色素瘤、非小细胞性肺癌等疾 病的治疗。
【主权项】
1. 一种胸腺素a1的固相片段合成方法，其特征在于：包括以下步骤： 胸腺素a: Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Gl u-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH，所述胸腺素a丨从C端到N端分为C末 端片段A、片段B和N末端片段E;所述C末端片段A包括4~6个氨基酸，所述片段B包括 8~10个氨基酸，所述N末端片段E包括2~4个氨基酸，所述C末端片段A和片段B在肽序 上为连续片段； 所述C末端片段A通过以下工艺获得： 步骤一、将Fmoc-Asn(Trt) -0H、H0Bt在溶剂中溶解后，再加入DIC活化形成氨基酸活化 液； 步骤二、将所述氨基酸活化液、WangResin树 月旨混合并加入二甲氨基吡啶进行缩合反应获得 Finoc-Asn28(Trt)-WaiigResiii,再去除Fmoc保护基； 步骤三、再根据肽序循环步骤一和步骤二，依次将Fmoc-Glu(OtBu) -〇H、Fmoc-Ala-〇H、Fmoc-Glu(OtBu) -OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH和Fmoc-Val-OH全部或部分缩合到树脂上，脱 除Fmoc得到全保护C末端片段A的肽树脂； 所述片段B通过以下工艺获得： 步骤一、将Fmoc-Glu(OtBu) -0H或者Fmoc-Val-OH在溶剂中溶解后，加入所需DIPEA总量的2/3,活化形成氨基酸活化液； 步骤二、将所述氨基酸活化液、2-CTCResin树脂混合并加入剩余1/3DIPEA进行缩合 反应获得氨基酸-CTCResin树脂，再去除Fmoc保护基获得脱保护氨基酸-CTCResin树 脂； 步骤三、将Fmoc-Val-OH或者Fmoc-Glu(OtBu)-0H与HOBt在溶剂中溶解后，再加入DIC/HOBt活化形成氨基酸活化液； 步骤四、将步骤三所述氨基酸活化液、步骤二的脱保护氨基酸-CTCResin树脂混合进 行缩合反应获得中间氨基酸-CTCResin树脂； 步骤五、再根据肽序循环步骤三和步骤四，按照肽序依次将若干个氨基酸直到Fmoc-Asp(OtBu) -0H逐步缩合到步骤四的树脂上，再通过TFE/DCM溶液（V/V=l/4)将多肽与 树脂分离从而获得全保护片段B; 将所述全保护片段B加入DCM/DMS0的混合溶剂，再依次加入DIC/HOBt活化后，再加 入所述全保护C末端片段A的肽树脂，缩合反应合成全保护片段C; 按照肽序，在全保护片段C的肽树脂依次将Fmoc-Lys(Boc)-〇H、Fmoc-Thr(tBu)-〇H、Fmoc-Thr(tBu)-〇H>Fmoc-Ile-〇H>Fmoc-Glu(OtBu)-〇H>Fmoc-Ser(tBu)-〇H> Fmoc-Ser(tBu) -OH、Fmoc-Thr(tBu) -OH、Fmoc-Asp(OtBu) -OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Ala-〇H、Fmoc_Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Ser(tBu)-OH中全部或部分偶联到全保护片段C 上，脱除Fmoc保护基团后得到全保护片段D肽树脂； 所述N末端片段E为逐步缩合法依次完成Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu) -OH和Fmoc-Ser(tBu) -OH中全部或部分与2-CTCResin树脂缩合，再将多 肽与树脂分离从而获得片段E; 将片段E全溶解于DMF/DCM=2/1的混合溶剂中，加入HOBt搅拌至全溶，，再投入所述全 保护片段D肽树脂，得到胸腺素a:肽树脂； 将胸腺素ai肽树脂加入裂解混合试剂，裂解2h，滤除树脂，得到滤液，将滤液缓缓加入 至冰冷的无水乙醚中，静置，去除上清液，离心、洗涤、真空干燥得到粗肽胸腺素ai。
2. 根据权利要求1所述的胸腺素a1的固相片段合成方法，其特征在于：合 成片段A时，制备Fmoc-Asn(Trt)_WangResin时，各原料的摩尔比为WangResin/ Fmoc-Asn(Trt) -OH/DIC/HOBt/DMAP= 1/2?4/2?4/2?4/0. 2?0? 4,反应温度为 20?35°C，反应 时间为l~2h。
3. 根据权利要求1所述的胸腺素a1的固相片段合成方法，其特征在于：所述裂解混 合试剂为为TFA/间甲酚=97. 5/2. 5 (V/V)，或者TFA/苯甲硫醚/EDT/苯甲醚=90/5/3/2(V/ V/V/V)。
4. 根据权利要求1所述的胸腺素a1的固相片段合成方法，其特征在于：所述片段B 工艺中多肽与树脂分离具体为：将全保护片段B肽树脂置于反应器中，加入25L的TFE/DCM 溶液（V/V=l/4)，25°C搅拌反应2h，反应结束后，滤除树脂，收集滤液，通过旋转蒸发仪旋去 有机溶剂，得到白色至浅黄色的胶状固体，放入真空干燥箱干燥至恒重。
5. 根据权利要求1所述的胸腺素a1的固相片段合成方法，其特征在于：还包括以下 步骤将粗肽胸腺素a:进行纯化、脱盐及冻干，其中纯化方式具体为：使用制备流动相的组 合为：一纯：A相为1%。TFA，B相为乙腈；二纯：A相为2%。磷酸，B相为乙腈；脱盐时A相为 50-100mm〇l/L的醋酸铵水溶液+纯水，B相为乙腈，分析流动相采用：A相为1%。高氯酸(取 lml的高氯酸，称取2. 36g甲烷磺酸钠加纯水定容至1L,用稀的氢氧化钠溶液调pH至2. 3)， B相为100%乙腈，C相为100%甲醇。
【专利摘要】本发明公开一种胸腺素α1的合成工艺，根据胸腺素α1的困难合成序列设计困合成多个片段；在困难序列的区域采用固相片段缩合方法，提高合成质量和缩短合成时间；而在易合成序列区域采用常规的逐步缩合法；在Wang？Resin上得到全保护的胸腺素α1肽树脂；使用TFA/间甲酚或TFA/苯甲硫醚/EDT/苯甲醚作为裂解试剂，裂解肽树脂得到粗肽；将粗肽溶解、过滤，通过制备型反相HPLC纯化、脱盐、旋蒸及冻干得到纯度可达到99%以上的胸腺素α1成品。本发明方法合成的粗肽纯度可达到80%左右，易纯化，总收率可达到30%。本发明方法生产胸腺素α1的总收率和产品质量比文献报道的其它方法均有了较大幅度的提高，且生产周期能缩短40-50%，降低了生产成本，适合于规模化制备高纯度的胸腺素α1。
【IPC分类】C07K1-06, C07K14-575, C07K1-04
【公开号】CN104558149
【申请号】CN201510031032
【发明人】王良友, 孙锋, 高鲁, 陈逸民, 夏丹, 黄保胜
【申请人】苏州天马医药集团天吉生物制药有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月22日