用于检测邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸甲苯基丁酯的单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽药残留分析和免疫学技术领域，具体涉及一种能识别邻苯二甲酸二 丁酯和邻苯二甲酸甲苯基丁酯的单克隆抗体及其应用。
【背景技术】
[0002] 邻苯二甲酸醋类（phthalateesters,PAEs)俗称塑化剂或酞酸醋，是邻苯二甲 酸的衍生物。邻苯二甲酸酯类基本结构是由一个苯环和两个侧链组成，两个侧链基团 可相同或不同，根据侧链的不同共有二十多种，常见的有邻苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate,DMP)、邻苯二甲酸二乙醋（diethylphthalate,DEP)，邻苯二甲酸二丁醋 (dibutylphtalate，DBP)，邻苯二甲酸二丙醋（dipropylphthalate,DPrP)、邻苯二甲酸二 (2-乙基己基）醋（di(2_ethylhexyl)phthalate，DEHP)等。邻苯二甲酸醋类常作为增塑剂 用于工业生产，这类物质添加到塑料制品中，提高塑料的柔韧性，因与塑料是一种物理性结 合，随着时间的推移，迀移至外界环境。由于塑化剂能代替棕榈油，产生增稠效果，不法商家 将便宜有毒的塑化剂添加到果冻、饮料，酸奶等食品中，通过食品进入人体，产生类雌性激 素效应，可以引起内分泌失调等。2011年在台湾食品中首次检出塑化剂后，2012年酒鬼酒 也检测出塑化剂，使塑化剂污染食品成为热门焦点，越来越受到消费者的关注。
[0003]欧盟在2007年发布了2007/19/EC指令，规定DEHP、DBP、BBP、DIDP、DINP、DnOP、 DAP特定迀移量（SML)分别为1.511^/1^、0.311^/1^、3〇11^/1^、911^/1^、911^/1^、511^/1^、小于 0. 01mg/kg，每天最大摄入量为0. 3mg/kg。美国环保署规定DBP、DEHP和BBP在育儿物品和 玩具中的含量不能超过0. 1%，DINP、DIDP和DNOP在育儿物品和3岁儿童使用的玩具中不 能超过0.1%。我国GB 9685-2008《食品容器、包装材料用添加剂使用卫生标准》也明确规 定DEHP、DBP、DINP在食品和食品添加剂中最大残留量分别为I. 5mg/kg、0. 3mg/kg、9. Omg/ kg，GB/T 21911-2008《食品中邻苯二甲酸酯的测定》规定：含油脂样品和不含油脂样品各 邻苯二甲酸醋化合物的检出限分别为I. 5mg/kg、0. 05mg/kg。因此，制备能识别邻苯二甲酸 酯类的单克隆抗体并研发高效的酶联免疫方法十分必要。
[0004] CN103257115A以4-氨基邻苯二甲酸二丁酯为半抗原，制备了能识别DBP的单克 隆抗体；CN104004719A以4-氨基邻苯二甲酸二丁酯作为半抗原，制备了能识别DBP、BBP、 DiBP、DNP、DMP的单克隆抗体，CN103869070A将邻苯二甲酸酐与正丁醇、4-氨基丁酸反应 得到的化合物作为半抗原，制备了能识别DBP、DiBP的单克隆抗体；CN103204925A以邻苯 二甲酸与6-(芴甲氧羰酰基-氨基）-1-己醇发生酯化反应，再脱去芴甲氧羰酰基保护基， 制备了一种邻苯二甲酸酯类通用半抗原，制备的抗体对DBP、DEHP和DINP的灵敏度低。可 见，目前邻苯二甲酸酯类的酶联免疫检测方法主要集中在半抗原的研宄，采用现有的半抗 原制备的单克隆抗体要么灵敏度和特异性差，要么能识别的邻苯二甲酸酯种类单一，现有 技术中尚没有能同时识别DBP和BBP的单克隆抗体。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种灵敏度高且能特异性识别邻苯二甲酸二丁酯和 邻苯二甲酸甲苯基丁酯的单克隆抗体。
[0006] 本发明的第二个目的是利用该单克隆抗体，制备一种用于邻苯二甲酸二丁酯和邻 苯二甲酸甲苯基丁酯检测的酶联免疫试剂盒。
[0007] 本发明的第三个目的是利用该试剂盒，建立一种能用于食品和饮料中邻苯二甲酸 二丁酯和邻苯二甲酸甲苯基丁酯残留检测的酶联免疫方法。
[0008] 本发明通过以下技术方案实现：
[0009] 一种能识别邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸甲苯基丁酯的单克隆抗体，它是由保 藏号为CCTCCN0:C201497的杂交瘤细胞株DBP3B2所分泌的。
[0010] 上述杂交瘤细胞株DBP3B2,保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，其保藏号 为CCTCCNO:C201497。
[0011] 制备所述的单克隆抗体所用的免疫原是由4-羟基邻苯二甲酸和正丁醇反应生成 的半抗原4-羟基邻苯二甲酸二丁酯，与人血清白蛋白（HSA)的偶联物。
[0012] 进一步，本发明提供了一种检测饮料中邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸甲苯基丁 酯残留的酶联免疫方法，该方法包括以下步骤：
[0013] (1)将4-羟基邻苯二甲酸和正丁醇为原料制备的半抗原4-羟基邻苯二甲酸二 丁酯（4-DBHP)，采用N，N-羰基二咪唑（⑶I)法与卵血清白蛋白（OVA)偶联得到包被原 (4-DBHP-CDI-0VA);
[0014] (2)用保藏号为CCTCCN0:C201497的杂交瘤细胞株DBP3B2制备单克隆抗体；
[0015] (3)用步骤⑴的包被原包被固相载体；
[0016] (4)将待测样品提取后进行酶联免疫检测。
[0017] 优选地，所述待测样品的提取方法是：将饮料离心，取上清，取2mL，加入体积比为 PBS缓冲液：乙醇=8 : 2的溶液8mL稀释。
[0018] 本发明以上述单克隆抗体和包被原作为核心试剂与常规的其他试剂组合，制成了 能检测邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸甲苯基丁酯的酶联免疫检测试剂盒，结合上述酶联 免疫方法，实现了对邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸甲苯基丁酯的酶联免疫检测。
[0019] 本发明的主要优点是：
[0020] 1)本发明在抗体制备时，采用4-DBHP作为半抗原，充分暴露了抗原决定簇，由该 抗原制备的单克隆抗体可同时识别邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸甲苯基丁酯，而现有的 单克隆抗体无法同时识别这两种药物。
[0021] 2)本发明建立的ELISA方法和试剂盒对DBP的最低检测限（IC5tl)仅为44. 33yg/ L，对BBP的最低检测限仅为62. 59yg/L，而且对BBP具有较高的交叉反应率，说明对DBP和 BBP这两种邻苯二甲酸酯塑化剂有较高的检测灵敏度和特异性。
[0022] 3)本发明建立的ELISA方法能同时检测饮料中的邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲 酸甲苯基丁酯，方法准确度高、检测效率高，与现有的方法相比，在检测种类上有明显的优 势，可以节省时间和成本，有很好的市场价值。方法中涉及的样品处理方法简单，易操作，所 用的有机试剂对操作者身体危害小。
【附图说明】
[0023] 图1为本发明所使用的半抗原、人血清白蛋白（HSA)和免疫原（4-DBHP-CDI-HSA) 的紫外扫描图谱。
[0024] 图2为本发明所使用的半抗原、卵血清白蛋白（OVA)和包被原（4-DBHP-⑶I-OVA) 的紫外扫描图谱。
[0025] 图3为本发明的单克隆抗体与邻苯二甲酸二丁酯标准品的间接竞争ELISA反应曲 线，X轴为邻苯二甲酸二丁酯标准溶液浓度对数值，Y轴为邻苯二甲酸二丁酯标准品溶液的 光密度值除以"零"孔光密度值（B/BJ。
【具体实施方式】
[0026] 下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。
[0027] 实施例1免疫原和包被原的制备
[0028] L1 免疫原4-DBHP-CDI-HSA制备
[0029] 称取4-羟基邻苯二甲酸3g溶于正丁醇4mL，搅拌条件下加入浓H2SO4 0.3mL催化， 100°C搅拌回流4h后，旋蒸，产物用10 %Na2CCV冼涤至水层无色（pH值为8)后，取有机层旋 蒸，即半抗原4-羟基邻苯二甲酸二丁酯（4-DBHP)。称取28mg4-DBHP溶解在200yLl，4-二 氧六环中，同时加入50mg⑶I(N，N-羰基二咪唑）和60mgDMAP(4-二甲氨基吡啶），混合物 室温活化过夜，将活化的反应液滴加到HSA40mg，4°C反应过夜，离心去上清，透析3d，每天 换2次透析液，透析液为pH7. 4磷酸盐缓冲液，透析后离心除去沉淀，低压冻干，即得包被原 4-DBHP-CDI-HSA。合成路线如下：
【主权项】
1. 一种能识别邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸甲苯基丁酯的单克隆抗体，它是由保藏 号为CCTCC N0:C201497的杂交瘤细胞株DBP3B2所分泌的。
2. -株杂交瘤细胞株DBP3B2,保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC N0:C201497,所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体能识别邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸 甲苯基丁酯。
3. 权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸甲苯基 丁酯的酶联免疫试剂盒中的应用。
4. 包含权利要求1所述单克隆抗体的试剂盒。
5. 根据权利要求4所述的试剂盒，该试剂盒是用于检测邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲 酸甲苯基丁酯的酶联免疫试剂盒。
6. 权利要求4或5所述的试剂盒在检测食品中邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸甲苯基 丁酯残留的应用。
7. -种用于检测饮料中邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸甲苯基丁酯残留的酶联免疫 方法，包括以下步骤： (1) 以4-羟基邻苯二甲酸二丁酯为半抗原，与卵血清白蛋白偶联得到包被原； (2) 用保藏号为CCTCC N0:C201497的杂交瘤细胞株DBP3B2制备单克隆抗体； (3) 用步骤（1)的包被原包被固相载体； (4) 将待测样品提取后进行酶联免疫检测。
8. 根据权利要求7所述的用于检测饮料中邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸甲苯基丁 酯残留的酶联免疫方法，其特征在于：所述待测样品的提取方法是：将饮料离心，取上清， 取2mL，加入体积比为PBS缓冲液：乙醇=8 : 2的溶液8mL稀释。
【专利摘要】本发明公开了一种能识别邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸甲苯基丁酯的特异性单克隆抗体，本发明还公开了一种用于检测邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸甲苯基丁酯的酶联免疫方法及试剂盒。本发明的单克隆抗体是由保藏号为CCTCC？NO:C201497的杂交瘤细胞株DBP3B2所分泌的。与现有技术相比，本发明制备的单克隆抗体可以同时识别邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸甲苯基丁酯，对DBP的最低检测限(IC50)仅为44.33μg/L，对BBP的最低检测限仅为62.59μg/L，而且对BBP具有较高的交叉反应率，因此对DBP和BBP这两种邻苯二甲酸酯塑化剂有较高的检测灵敏度和特异性。CCTCC NO:C20149720140520
【IPC分类】G01N33-543, C12N5-20, G01N33-577, C07K16-44
【公开号】CN104558182
【申请号】CN201410829812
【发明人】袁宗辉, 王玉莲, 赵兰, 彭大鹏, 潘源虎, 陈冬梅, 陶燕飞, 刘振利
【申请人】华中农业大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月26日