一种游动放线菌菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物工程技术领域，尤其涉及一株游动放线菌及其在制备非达霉素 (Fidaxomicin)中的应用。
【背景技术】
[0002] 由艰难梭菌感染所导致的腹泻及结肠炎和其他肠道疾病具有高致病性和高致死 率的特性。早在2003年，艰难梭菌就在加拿大多个省引起感染疫情暴发。截至2008年 10月，高致病性和高病死率的艰难梭菌核糖体027型，至少引起了美国40个州的医院内感 染暴发。在北美发现027型后不久，欧洲有17个国家也相继出现了艰难梭菌的暴发流行。 欧洲已将艰难梭菌列为强制监测病原体，在欧洲疾病预防控制中心（ECDC)领导下分别于 2002年、2005年、2008年进行了三次全欧洲流行病学调查。长期以来，艰难梭菌相关性腹 泻（CDAD)治疗一直是医学界研究的重大课题，寻找治疗CDAD的新药更是药物研究人员的 重要任务。
[0003] 2011年美国FDA批准Optimer药业公司生产的大环内酯类新药非达霉 素（Fidaxomicin)，其商标名为Dificid，用于治疗艰难梭菌相关性腹泻（CDAD)。非 达霉素为R-台勾霉素 B。Robert等人1986年在US4918174专利首次公开了指孢囊 菌（Dactylosporangium aurantiacum subsp.hamdenensis NRRL18085)能够发酵产 生一种能够有效抑制革兰氏阳性菌的抗生素台勾霉素（Tiacumicin)及其结构。闰 年霉素（Lipiarmycins)是一族与Tiacumicin非常相关的一系列化合物，闰年霉素 (Lipiarmycins)A3 和 B3 分别与台勾霉素（Tiacumicins)B 和 C 相同（J. Antibiotics， 1988,308-315. )。US3978211专利公开了闰年霉素（Lipiarmycins)及其生产菌德干高 原游动放线菌（Actinoplanes deccanensis A / 10655ATCC21983)。J. Antimicrobial Chemotherapy2008,62, 713-719,报道了 Lipiarmycin A3 的生产菌 Catellatospora sp. Bp3323_81。以上 Tiacumicin 和 Lipiarmycin 的产生菌存在目的产物（Tiacumicin 和 Lipiarmycin)效价低、产量波动性大、不稳定、生产成本高等缺点，因此寻找一种新的高效 非达霉素（Fidaxomicin)的生产菌种的工作仍然在继续进行中。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的之一在于提供一种新的游动放线菌HS-16-20 (Actinoplanes sp. HS-16-20)，具有生产非达霉素的能力，其保藏编号为CGMCC NO. 7294。
[0005] 本发明的目的还在于提供了一种游动放线菌HS-16-20 (CGMCC NO. 7294) (Actinoplanes sp. HS-16-20)，其可应用于生产非达霉素或其类似物，或者应用于生产含 有非达霉素的药物组合物。
[0006] 本发明还提供了 一种采用游动放线菌HS-16-20 (CGMCC NO. 7294)制备非达霉素或 其类似物的方法。该方法包括采用游动放线菌HS-16-20 (CGMCC NO. 7294)在含有可同化的 碳源、氮源的营养培养基里进行有氧发酵的过程。
[0007] 优选的，上述可同化的碳源选自蔗糖、葡萄糖、果糖、鼠李糖、棉子糖、木糖、阿拉伯 糖、工业糖蜜、乳糖、半乳糖、麦芽糖、海藻糖、木聚糖、糊精、淀粉、山梨醇、水杨苷、肌醇、甘 露醇、甘油、甘氨酸、菊粉之一或者上述物质的组合。
[0008] 优选的，上述可同化的氮源选自牛肉浸膏、酵母浸膏、酵母抽提物、酵母粉、蛋白 胨、胰蛋白胨、麸质粉、棉籽饼粉、花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆干粉、麸皮、尿素、铵盐、硝酸 盐之一或上述物质的组合。
[0009] 优选的，所述发酵培养的温度为20°C -40°C，优选25°C -30°C，pH为6. 0-8. 0,优选 7. 0,培养时间为144-240小时，通气量为0. 5-1. Ovvm。
[0010] 优选的，所述发酵方式为液体深层发酵。
[0011] 本发明还提供了分离纯化非达霉素的方法。该方法包括将发酵液通过萃取、浓缩、 柱层析纯化等步骤制备该化合物。
[0012] 非达霉素可通过以下条件进行HPLC检测：
[0013] 色谱柱为 C18 柱，5μπι，4· 6X250nm ;
[0014] 流动相 A 相：0· 05%磷酸（v / v);
[0015] 流动相B相：90%乙腈（V / V);
[0016] 流速：I. OOml / min ;
[0017] 检测波长：250nm;
[0018] 程序：0-20min :5 % -100 % B 相；20-21min :100 % B 相；21-22min :100 % -5 % B 相；
[0019] 进样量：10μ1。
[0020] 本发明所采用的非达霉素产生菌为游动放线菌HS-16-20 (CGMCC NO. 7294)。
[0021] 本发明游动放线菌HS-16-20(CGMCC NO. 7294)的微生物菌种于2013年3月11 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路 1号院，中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCC NO. 7294,分类命名为游动放线菌 Actinoplanessp.，并登记入册，证明存活。
[0022] 本发明游动放线菌HS-16-20的主要生物学特征为：菌落颜色橘黄色，菌落形态较 圆整，表面有皱褶凸起，直径大小为中型左右），菌落稍湿润，菌丝与培养基结合较疏 松，易挑取。
[0023] 本发明描述了游动放线菌HS-16-20的形态学和分子水平上的特征，经过与已知 台勾霉素和闰年霉素产生菌进行形态学和分子水平的比较，可以认定游动放线菌HS-16-20 属于游动放线菌，但它不同于已知的台勾霉素和闰年霉素产生菌Dactylosporangium aurantiacum subsp.hamdenensis NRRL18085, Actinoplanes deccanensis A / 10655ATCC21983, Catellatospora sp.Bp3323-81，而是一种全新的菌种。
[0024] 本发明游动放线菌HS-16-20与现有技术中非达霉素的产生菌相比具有以下优 占·
[0025] 本发明游动放线菌HS-16-20提高了发酵单位。本发明游动放线菌HS-16-20产生 非达霉素或其类似物的产量较原始菌种有了大幅度的提高，有利于实现工业化生产。
【附图说明】
[0026] 图1为本发明实施例8制备得到的非达霉素纯品的HPLC图谱。
[0027] 图2为本发明实施例8制备得到的非达霉素纯品的ESI / MS图谱。
[0028] 图3为本发明实施例8制备得到的非达霉素纯品的1H-NMR图谱。
[0029] 图4为本发明实施例8制备得到的非达霉素纯品的13C-NMR图谱。
【具体实施方式】
[0030] 实施例1 :菌株来源
[0031] 游动放线菌 HS-16-20 (Actinoplanes sp. HS-16-20, CGMCC NO. 7294)系从浙江台 州白云山顶土壤样品中分离得到的一株放线菌。
[0032] 在台州白云山划定的区域内进行交叉采样，随机取5个采样点，每个点取土壤样 品10g，放入锥形瓶内，混合均匀后取样品10g，加入到一个装有90mL去离子水的锥形瓶中 (瓶中有一个磁力搅拌器），旋涡搅拌30min，使其充分混匀制成悬浊液，即为KT 1菌液。用稀 释涂布平板法将上述悬浊液与无菌水按体积比1 :9稀释成1(Γ2,1(Γ3,10Λ KT5浓度，取不同 稀释倍数菌液〇. lmL，涂布于IPS2培养基平板中，用无菌涂棒在培养基表面轻轻涂布，室温 下静置30min后置于28°C恒温培养箱。待菌落长出后，观察记录菌落颜色、透明度、菌落表 面、边缘形态，检查其特征是否一致。挑选形态特征一致的菌落进行点种操作，并将点种后 的平板置于28°C恒温培养箱培养8天，待菌丝成熟后挑出1000株初筛菌株，然后在无菌条 件下用接种铲将上述初筛菌株刮下，分别接种到250mL锥形瓶中（每瓶含有25mL种子培养 基），于28°C条件下振荡培养28小时，得种子液。将种子液以15-20%的移种量分别接种到 250mL锥形瓶中（每瓶含有20mL发酵培养基），于28 °C条件下振荡培养8天后，经HPLC检测 所得发酵液中非达霉素的含量，挑选出最高产菌株即游动放线菌HS-16-20 (Actinoplanes sp. HS-16-20) 〇
[0033] 实施例 2 :游动放线菌 HS-16-20 (Actinoplanes sp. HS-16-20, CGMCC NO. 7294)的 形态学和培养学特征
[0034] 参照《常见细菌系统鉴定手册》、《分子克隆实验指南》及《中国药典》（2010版）等 书中的有关内容进行实验。菌株的形态学和培养学特征实验采用ISP1、ISP2、ISP3、ISP4、 ISP5、高氏一号、苹果酸钙、LB、YMS和查氏培养基10种培养基，28°C培养7?10天后，观察 菌丝体的颜色及色素情况。结果见表1。
[0035] 表1菌株HS-16-20在10种培养基上的培养特征
[0036]
【主权项】
1. 一种游动放线菌（Actinoplanes sp.)HS-16-20,其保藏编号为 CGMCC N0.7294。
2. 根据权利要求1所述的游动放线菌HS-16-20在制备非达霉素中的应用。
3. -种发酵生产非达霉素的方法，其特征在于：包括采用权利要求1所述的游动放线 菌HS-16-20在含有可同化的碳源和氮源的营养培养基里，进行有氧发酵的步骤。
4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述可同化的碳源选自蔗糖、葡萄 糖、果糖、鼠李糖、棉子糖、木糖、阿拉伯糖、工业糖蜜、乳糖、半乳糖、麦芽糖、海藻糖、木聚 糖、糊精、淀粉、山梨醇、水杨苷、肌醇、甘露醇、甘油、甘氨酸、菊粉之一或者上述物质的组 合。
5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述可同化的氮源选自牛肉浸膏、酵 母浸膏、酵母抽提物、酵母粉、蛋白胨、胰蛋白胨、麸质粉、棉籽饼粉、花生饼粉、黄豆饼粉、玉 米浆干粉、麸皮、尿素、铵盐、硝酸盐之一或上述物质的组合。
6. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述发酵培养的温度为20°C? 40°C，pH为6. 0-8. 0,培养时间为144-240小时。
【专利摘要】本发明公开了一株游动放线菌菌株及其应用，该菌株命名为游动放线菌(Actinoplanes？sp.)HS-16-20，保藏编号为CGMCC？NO.7294。本发明的游动放线菌HS-16-20可产生非达霉素(Fidaxomicin)，该化合物对各种革兰氏阳性细菌病原体，特别是针对艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium？difficile)具有很好的抑制作用，可有效治疗艰难梭菌相关性腹泻(CDAD)，显示出很好的商业开发前景。CGMCC NO729420130311
【IPC分类】C12R1-045, C12P19-62, C12N1-20
【公开号】CN104560766
【申请号】CN201310501389
【发明人】徐浩, 汤飞, 詹佩君, 胡建红, 程莎莎, 任会军, 樊红梅, 白骅
【申请人】浙江海正药业股份有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月16日
【公告号】WO2015055107A1