结核分枝杆菌生物被膜体外培养的培养基及培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于结核分枝杆菌治病机制及耐药性研究技术领域，具体涉及结核分枝杆菌生物被膜体外培养的培养基及培养方法。
【背景技术】
[0002]结核病是一种古老的传染病，是由结核分枝杆菌引起的一种人兽共患、慢性、消耗性疾病。结核病的最常发病部位为肺部，可通过空气传播，在19世纪以前一直被视为不治之症。在19世纪四十年代以后，一系列抗结核的药物出现，使结核病得到了控制。但是耐药菌株随之出现，近年来又出现多耐药菌株、泛耐药菌株，加之部分患者混合感染有艾滋病，导致结核病感染率、发病率和死亡率呈逐年上升趋势。全球有将近三分之一的人口潜伏感染，且在每年将近1000万的新发病结核病患者中，有170万人死亡。所以近年来结核分枝杆菌的致病机制以及耐药性的研究成为热点。
[0003]在自然环境中细菌以浮游或者生物被膜两种形式存在，细菌生物被膜是指细菌附着于惰性或者活性实体的表面繁殖分化并分泌一些多糖基质将菌体群落包裹其中而形成的细菌聚集体膜状物。大量研究证明，结核分枝杆菌也能形成生物被膜，且生物被膜的形成与免疫逃避有密切联系，并可以显著增强结核分枝杆菌的耐药性。
[0004]目前各国学者进行结核生物被膜的培养，多采用文献(Anil K.0jha etc, Growthof Mycobacterium tuberculosis b1films containing free mycolic acids andharbouring drug-tolerant bacteria)描述的方法。
[0005]本发明采用改良苏通培养基进行结核分枝杆菌生物被膜快速培养，有助于临床和药物研究人员筛选出有效的抗结核潜在药物，为结核分枝杆菌致病机制以及耐药性研究奠定基础。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是为了缩短结核分枝杆菌生物被膜体外培养的时间，提高生物被膜产量，而提供一种结核分枝杆菌生物被膜体外培养的培养基及培养方法。
[0007]结核分枝杆菌生物被膜体外培养的培养基，它包括:天冬酰胺4g、枸橼酸2g、三水合磷酸氢二钾0.3-lg、七水合硫酸镁0.5-lg、无水朽1檬酸铁铵0.05-lg、甘油60ml、加去离子水、氨水调节pH至7.0，定容至1000ml ；
所述的三水合磷酸氢二钾0.4-0.6g、七水合硫酸镁0.5-0.6g、无水柠檬酸铁铵0.4-0.7g ；
所述的三水合磷酸氢二钾0.5g、七水合硫酸镁0.5g、无水柠檬酸铁铵0.5g。
[0008]结核分枝杆菌生物被膜体外培养方法，它包括:
1)将结核分枝杆菌标准株单菌落接入7H9B培养基中培养，生长至对数期；
2)将15ml前述的结核分枝杆菌生物被膜体外培养基加入50ml玻璃灭菌血清瓶中，接种0.5ml步骤I)的培养物，拧紧瓶盖； 3)培养箱中静置培养；
所述的7H9B培养基为:4.7g 7H9粉末，0.5ml吐温_80，去离子水900ml，装于锥形瓶中121摄氏度高压10分钟，待温度降到45摄氏度后加入OADC增菌液10ml ；
所述的7H9粉末为:硫酸铵0.5g，磷酸氢二钠2.5g，磷酸二氢钾1.0 g，七水合硫酸镁0.05 g，氯化钙0.0005 g，硫酸锌0.001 g，五水合硫酸铜0.01 g，谷氨酸钠0.5 g，二水合柠檬酸钠0.1g,盐酸吡哆醇0.0Olg,生物素0.0005g,柠檬酸铁铵0.04g。
[0009]本发明提供了结核分枝杆菌生物被膜体外培养的培养基，它包括:天冬酰胺4g、枸橼酸2g、三水合磷酸氢二钾0.3-lg、七水合硫酸镁0.5-lg、无水柠檬酸铁铵0.05-lg、甘油60ml、加去离子水、氨水调节pH至7.0,定容至100ml ;采用该结核分枝杆菌生物被膜体外培养的培养基，用血清瓶体外培养结核分枝杆菌生物被膜，生物被膜生长时间缩短一周左右，比传统方法培养时间缩短一周左右，相同时间内被膜厚度高于传统方法，提高了被膜的产量。为研究结核分枝杆菌致病机制、耐药性以及药物筛选提供了有利条件。
【附图说明】
[0010]图1利用传统方法培养结核分枝杆菌标准株(IcoAacteria? tuberculosisATCC27294)生物被膜21天照片；
图2利用传统方法培养结核分枝杆菌标准取{Mycobacterium tuberculosisATCC27294)生物被膜35天照片；
图3利用本专利所述的方法培养结核分枝杆菌标准株dcoAacieriw? tuberculosisATCC27294)生物被膜20天照片；
图4利用本专利所述的方法培养结核分枝杆菌标准株dcoAacieriw? tuberculosisATCC27294)生物被膜30天照片；
图5利用本专利所述的方法培养结核分枝杆菌标准株dcoAacieriw? tuberculosisATCC27294)生物被膜40周照片。
【具体实施方式】
[0011]实施例1利用传统方法培养结核分枝杆菌标准株dcoAacieriw? tuberculosisATCC27294)生物被膜
1.培养基准备:
a.1000ml的7H9B培养基的配制方法为:4.7g商品化7H9粉末，0.5ml吐温-80，去离子水900ml，装于锥形瓶中121摄氏度高压10分钟，待温度降到45摄氏度后加入OADC增菌液 10ml ο
[0012]b.1OOOml的苏通培养基:天冬酰胺4g、枸橼酸2g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁0.5g、无水朽1檬酸铁铵0.05g、甘油60ml、加去离子水至900ml、氢氧化钠调节至7.0,定容至1000ml, 121摄氏度高压灭菌15min。在实验之前加入无菌硫酸锌lg。
[0013]2.接种物准备:将结核分枝杆菌标准株单菌落接入还有150ml 7H9B培养基的锥形瓶中，150rpm/min摇动培养I周，生长至对数期；
3.用紫外分光光度计测菌液的0D600吸光度值为1.1，向10份菌液中加入I份新鲜7H9B培养基，测0D600吸光度值至0.9，符合0D600值为0.7-1.0 ； 4.分装25ml苏通培养基于250ml螺帽聚丙乙烯瓶中，向瓶中加入0.25ml步骤3中接种物，将瓶盖拧到最紧，在37度培养箱中静置3周，生长至3周时，气液界面形成薄膜，图1为生物被膜生长至3周的状态。经常观察确定是否污染。
[0014]5.在第3周末，在生物安全柜中松开瓶盖，使新鲜空气进入，再拧紧瓶盖，继续培养1-2周，生长至5周末，被膜成熟，不再生长，图2为生物被膜生长至5周的状态。
[0015]实施例2利用本专利所述的方法培养结核分枝杆菌标准株dcoAacieriw?tuberculosis A TCC27294 )生物被膜
1.培养基准备:
a.1000ml的7H9B培养基的配制方法为:4.7g商品化7H9粉末，0.5ml吐温-80，去离子水900ml，装于锥形瓶中121摄氏度高压10分钟，待温度降到45摄氏度后加入OADC增菌液 10ml ο
[0016]b.1OOOml的改良苏通培养基:天冬酰胺4g、枸橼酸2g、三水合磷酸氢二钾0.5g、七水合硫酸镁0.5g、无水朽1檬酸铁铵0.5g、甘油60ml、加去离子水至900ml、氨水调节至7.0,定容至1000ml, 121摄氏度高压灭菌15min。
[0017]2.接种物准备:将结核分枝杆菌标准株单菌落接入还有150ml 7H9B培养基的锥形瓶中，150rpm/min摇动培养I周，生长至对数期；
3.用紫外分光光度计测菌液的0D600吸光度值为1.1，向10份菌液中加入I份新鲜7H9B培养基，测0D600吸光度值至0.9，符合0D600值为0.7-1.0 ；
4.分装15ml改良苏通培养基于50ml玻璃灭菌血清瓶中，向瓶中加入0.5ml步骤3中接种物，拧紧瓶盖；
5.将3中还有培养物血清瓶静置于37度培养箱中，培养3周以上。
[0018]生物被膜生长至20天时，已经有大量细菌粘附于瓶壁形成支架，此时被膜较薄但生长迅速，图3为生物被膜生长至20天的状态；生物被膜生长至30天时，细菌继续增殖粘附于瓶壁，被膜变厚，进入成熟期，图4为生物被膜生长至30天的状态；生物被膜生长至40天时，被膜厚度达到最大，被膜生长变缓，图5为生物被膜生长至40天的状态。
【主权项】
1.结核分枝杆菌生物被膜体外培养的培养基，它包括:天冬酰胺4g、枸橼酸2g、三水合磷酸氢二钾0.3-lg、七水合硫酸镁0.5-lg、无水朽1檬酸铁铵0.05-lg、甘油60ml、加去离子水、氨水调节pH至7.0，定容至1000ml。
2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌生物被膜体外培养的培养基，其特征在于:所述的三水合磷酸氢二钾0.4-0.6g、七水合硫酸镁0.5-0.6g、无水柠檬酸铁铵0.4-0.7g。
3.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌生物被膜体外培养的培养基，其特征在于:所述的三水合磷酸氢二钾0.5g、七水合硫酸镁0.5g、无水柠檬酸铁铵0.5g。
4.结核分枝杆菌生物被膜体外培养方法，它包括: 1)将结核分枝杆菌标准株单菌落接入7H9B培养基中培养，生长至对数期； 2)将15ml前述的结核分枝杆菌生物被膜体外培养基加入50ml玻璃灭菌血清瓶中，接种0.5ml步骤I)的培养物，拧紧瓶盖； 3)培养箱中静置培养。
5.根据权利要求4所述的结核分枝杆菌生物被膜体外培养方法,其特征在于,所述的7H9B培养基为:4.7g 7H9粉末，0.5ml吐温_80，去离子水900ml，装于锥形瓶中121摄氏度高压10分钟，待温度降到45摄氏度后加入OADC增菌液100ml。
6.根据权利要求5所述的结核分枝杆菌生物被膜体外培养方法,其特征在于,所述的7H9.粉末为:硫酸铵0.5g，磷酸氢二钠2.5g，磷酸二氢钾1.0 g，七水合硫酸镁0.05 g，氯化钙0.0005 g，硫酸锌0.001 g，五水合硫酸铜0.01 g，谷氨酸钠0.5 g，二水合柠檬酸钠.0.1g,盐酸吡哆醇0.0Olg,生物素0.0005g,柠檬酸铁铵0.04g。
【专利摘要】本发明公开了结核分枝杆菌生物被膜体外培养的培养基，它包括：天冬酰胺4g、枸橼酸2g、三水合磷酸氢二钾0.3-1g、七水合硫酸镁0.5-1g、无水柠檬酸铁铵0.05-1g、甘油60ml、加去离子水、氨水调节pH至7.0，定容至1000ml；采用该结核分枝杆菌生物被膜体外培养的培养基，用血清瓶体外培养结核分枝杆菌生物被膜，生物被膜生长时间缩短一周左右，比传统方法培养时间缩短一周左右，相同时间内被膜厚度高于传统方法，提高了被膜的产量。为研究结核分枝杆菌致病机制、耐药性以及药物筛选提供了有利条件。
【IPC分类】C12N1-20, C12R1-32
【公开号】CN104560795
【申请号】CN201410788904
【发明人】于录, 杨志强, 郭娜, 唐旭东, 范君文, 汪杨, 孟日增, 宋宇, 张巧丽, 王超
【申请人】吉林大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月19日