一株兼性厌氧砷氧化副球菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及环境微生物技术领域，具体涉及一株兼性厌氧砷氧化副球菌及其应 用。
【背景技术】
[0002] 砷（As)是一种有剧毒的类金属。在我国南方地区，受采矿和金属冶炼的影响，农 田砷污染情况已经相当严重。砷污染严重的水稻土壤中，较高浓度的As会对水稻产生毒害 效应，危害其生长发育，并降低农作物产量和品质。由于稻田的水分管理方式以水稻对三价 砷（As(III))的快速吸收，水稻通常会比其他作物富集更高含量的砷。稻米已经成为水稻 生产和消费地区最为主要的砷的食物暴露途径。
[0003] 生物修复法是利用生物的代谢机制吸收、沉淀、降解或氧化还原一定浓度的有毒 有害污染物，将污染物移走或降低其有效性。由于生物修复投资较少，可直接进行原位修 复，且不会造成二次污染，所以是一种最有前景的污染修复手段。前期研宄表明淹水条件下 水稻土存在细菌亚砷酸氧化酶的基因，说明亚砷酸氧化菌的存在。水稻土壤中的砷氧化细 菌可以将三价砷氧化为五价砷，由于土壤中的铁氧化物对五价砷吸附能力强，从而降低了 土壤中的砷的生物有效性和生物毒性。该法作为一种最有前景的砷污染治理方法，具有经 济高效且无害等优点。
[0004] 与硝酸盐还原耦合的三价砷氧化是由微生物介导的酶促反应，具有砷氧化功能 和硝酸盐还原活性的细菌是反应得以进行的关键。目前，已经发现三价砷氧化耦合硝 酸盐还原的细菌只有固氮弧菌属（Azoarcus sp.)、中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.)、 AlkalilimnicolaehrlichiiMLHE-I等几个属。尚未发现来源于水稻土的厌氧砷氧化细菌， 所以分离筛选厌氧砷氧化细菌可以促进三价砷在水稻土及水稻根际氧化，从而降低砷的有 效性及水稻籽粒的砷积累。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一株兼性厌氧砷氧化副球菌。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供厌氧砷氧化副球菌在砷污染土壤中的应用。
[0007] -株兼性厌氧砷氧化副球菌（Paracoccusarsenicoxydans) SY，保藏于中国典型培 养物保藏中心，保藏日期为2014年10月8日，保藏编号为：CCTCC N0:M2014456。
[0008] 菌株特征、分离步聚、砷氧化活性鉴定方法
[0009] (1)菌体形态特性
[0010] 采用常规细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，该菌株为革兰氏阴性菌，球 状，大小为〇· 4-0. 6X0. 6-1. 0 μ m，细菌不具有运动性。
[0011] ⑵菌落形态特性
[0012] 在牛肉膏蛋白胨琼脂固体培养基平板上好氧培养24小时后，菌落形态为圆形，表 面凸起，边缘整齐，橙黄色，菌落大小（d)为1?2mm;在上述培养基上好氧培养48小时后， 菌落形态为圆形，表面光滑扁平，边缘整齐，红色，菌落大小（d)为2?3_。
[0013] (3)主要的生理、生化特性
[0014] 在好氧条件下氧化酶反应为阳性，硝酸盐还原为阳性，柠檬酸盐利用试验为阴性。 具有兼性厌氧生长的能力；在好氧条件下，用API 32GN鉴定后发现，在32种不同碳源中，该 菌能利用其中的12种。在厌氧条件下能氧化的电子供体有：甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、乳酸 盐。
[0015] (4) 16S rRNA序列和系统发育分析
[0016] 采用SDS-蛋白酶K，氯仿-异戊醇（体积比24:1)抽提，0.6体积异丙醇沉淀的 方法提取细菌总DNA。采用细菌16SrRNA通用引物F27和R1492扩增细菌的16SrRNA， 在1500bp附近出现明显的条带，将PCR扩增产物回收后进行序列测定，将获得的DNA 序列输入GenBank，以Blastn程序对数据库中的所有序列进行比对。该菌株与副球菌 属的所有细菌的同源性均小于97%，该菌株是副球菌属的一株新种。结合上述的生 理生化特性、16 S r RNA序列的结果，该菌株应归属于副球菌属，命名为砷氧化副球菌 (Paracoccusarsenicoxydans)SY 0
[0017] (5)砷氧化酶基因鉴定
[0018] 先用兼并引物（Qu6m6neur et al. Diversity surveys and evolutionary relationships of aoxB genes in aerobic arsenite-〇xidizing bacteria.Appl. Environ. Microbiol. 2008, 74 (14)，4567-4573)扩增 I. Ikb 的砷氧化酶基因的保守片段，再 用SEFA-PCR的方法扩增出侧翼的砷氧化酶基因（aioA)，该序列已经提交至NCBI GenBank， 注册号为KM594555。
[0019] 本发明所述的砷氧化副球菌SY在修复三价砷污染水体或土壤中的应用。
[0020] 本发明所述的砷氧化副球菌SY在淹水砷污染水稻土壤中砷氧化的应用。
[0021] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0022] 1)提供一株兼性厌氧砷氧化副球菌SY，能够在好氧和反硝化条件下固定0)2氧化 As(III) 〇
[0023] 2)砷氧化副球菌SY可以将三价砷氧化为五价砷，可以用于砷污染土壤的污染治 理，降低土壤中砷的毒害，尤其是应用于淹水砷污染水稻土壤中氧化三价砷。
【附图说明】
[0024] 图1 :砷氧化菌株S Y的扫描电镜图片。
[0025] 图2 :砷氧化菌株SY系统发育分析。
[0026] 图3 :好氧条件下菌株SY氧化As (III)的曲线。
[0027] 图4 :反硝化条件下菌株SY氧化As (III)的曲线。
[0028] 图5 :土壤溶液（A)和土壤磷酸提取液（B)中砷的含量。
[0029] 生物材料保藏信息
[0030] SY，分类命名为Paracoccus sp. SY，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为 中国武汉?武汉大学，保藏日期为2014年10月8日，保藏编号为：CCTCCN0 :M2014456。
【具体实施方式】
[0031] 实施例I :菌种的分离、纯化
[0032] 取5g浙江上虞砷污染水稻土壤样品于60mL液体培养基中，培养基组成为（g/L): 7. 9g Na2HPO4 · 7H20,1. 5g KH2PO4, 0· 3g NH4Cl，0· Ig MgSO4 · 7H20,维生素溶液 10. OmL (每升 维生素溶液含：生物素2. Omg，叶酸2. Omg，维生素 B6IO. Omg，核黄素5. Omg，维生素 BjOmg， 烟酸5. Omg，泛酸5. Omg，维生素 B12O. lmg，硫辛酸5. Omg)，微量元素溶液5. OmL (每升微量元 素溶液中含：三乙酸钠盐 I. 5g，MgS04 ·7Η20 3. 0g，MnS04 ·Η20 0· 5g，NaCl I. 0g，FeS04 ·7Η20 0· lg，CoCl2 · 6H20 0· lg，CaCl2O. lg，ZnSO4 · 7H20 0· lg，CuSO4 · 5H20 0· Olg，AlKSO4 · 12H20 0· Olg，H3BO3O. Olg，Na2M0O4O. Olg，NiCl2 · 6H20 0· 024g)，10mMHC(V(NaHC03)，ImM As(III) (NaAsO2)和5mM NO,（KNO3)。接种前往培养液中鼓充高纯混合气体（N2/C02= 80/20)彡I 小时，铝盖密封，培养液置于厌氧工作站（N2AX)2= 80/20)，30°C静置培养。
[0033] 每隔一周检测溶液中的As (III)和N03_的转化效果。当As (V)含量不断增加时， 以5 %的接种量富集培养三次，然后稀释，均匀涂布于固体培养基上（每升培养液加10克琼 月旨，其它成分同上述液体培养基），置于厌氧工作站（N 2AX)2= 80/20) 30°C培养一周，挑取单 菌落进行分离、纯化，得到一株兼性厌氧砷氧化菌SY。
[0034] 实施例2 :菌种的鉴定
[0035] (1)生理生化性质的测定：
[0036] 表1.菌株SY的生理生化特性
[0037]
【主权项】
1. 一株兼性厌氧砷氧化副球菌（Paracoccus arsenicoxydans)SY，保藏于中国典型培 养物保藏中心，保藏日期为2014年10月8日，保藏编号为：CCTCC N0:M2014456。
2. 权利要求1所述的兼性厌氧砷氧化副球菌SY在修复三价砷污染水体或土壤中的应 用。
3. 权利要求1所述的兼性厌氧砷氧化副球菌SY在淹水砷污染水稻土壤中砷氧化的应 用。
【专利摘要】本发明公开了一株厌氧砷氧化副球菌及其应用。砷氧化副球菌(Paracoccus？arsenicoxydans)SY，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年10月8日，保藏编号为：CCTCC？NO：M2014456。本发明中的SY可以在好氧和厌氧的条件下氧化三价砷，具有很强的砷氧化速率，同时可以修复砷污染水稻土壤。CCTCC NO：M201445620141008
【IPC分类】C02F3-34, C02F101-20, B09C1-10, C12R1-01, C12N1-20
【公开号】CN104560812
【申请号】CN201410840941
【发明人】赵方杰, 张隽, 周武先, 刘冰冰
【申请人】南京农业大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月30日