纳米磁珠法筛选呼吸道合胞病毒记忆性b细胞的方法
【专利说明】纳米磁珠法筛选呼吸道合胞病毒记忆性B细胞的方法
[0001]
技术领域
[0002]本发明涉及一种呼吸道合胞病毒抗原标记纳米磁珠分离记忆B细胞的筛选方法。
【背景技术】
[0003]呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)属副黏病毒科肺炎属，是冬春季婴幼儿下呼吸道感染最常见的病原体，特别是2至6个月小婴儿，免疫功能缺陷的成年人及老年人也是RSV的易感人群，RSV感染后常发生严重的毛细支气管炎和肺炎，全球范围内每年有1%。?5%。的患儿住卩元治疗RSV，病人病死率为1%。?3%。。因此快速而全面地诊断并高效治疗RSV感染者势在必行。
[0004]目前针对于RSV感染者的快速检测技术的改进，以及针对RSV疫苗和抗体的研宄成为了热点，呼吸道合胞病毒感染者的传统检测方法是检测病人血清中的RSV抗体，但这只能检测急性感染者以及最近感染的已康复者，并不能全面监测出具有RSV感染史者；此夕卜，目前针对RSV的抗体研宄已经从针对RSV的记忆性B细胞进行研宄，但通常的方法都是将分离到的人外周血单核细胞进行再分离，得到记忆性B细胞库后，再进行体外刺激培养一段时间，筛选出能特异性分泌RSV抗体的浆细胞，从而间接地识别出针对人呼吸道合胞病毒的记忆性B细胞。许多研宄表明，具有RSV感染史者拥有长期存在于体内的针对人呼吸道合胞病毒的记忆性B细胞，该细胞表面一般都具有IgM和IgD。所以，可利用抗原抗体特异性结合原理，特异性地将针对人呼吸道合胞病毒的记忆性B细胞结合在连接有呼吸道合胞病毒抗原蛋白GD和FD的纳米磁珠上，从而将针对呼吸道合胞病毒的记忆性B细胞从人外周血单核细胞中分离出来。因此，本研宄能应用于针对RSV感染史者的全面监测，以及为针对RSV抗体的研宄提供理论基础和技术支持。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于针对现有监测RSV感染史者和研宄RSV抗体制备方法的不足，提供一种纳米磁珠筛选呼吸道合胞病毒记忆性B细胞的制备方法。
[0006]本发明是利用抗原抗体特异性结合原理，将人外周血单核细胞中的针对人呼吸道合胞病毒的记忆性B细胞，特异性地结合在连接有呼吸道合胞病毒抗原蛋白GD和FD的纳米磁珠上，从而将针对呼吸道合胞病毒的记忆性B细胞从人外周血单核细胞中分离出来。
[0007]本发明所述制备方法包括下列步骤:
1、连接纳米磁珠和GD和GL抗原蛋白:将呼吸道合胞病毒抗原蛋白GD和FD各20ul分别加入至含有1ul结合缓冲液的纳米磁珠中，室温，垂直混合过夜；用磁铁吸附纳米磁珠，去掉上清，加入10ul清洗缓冲液II，用移液枪吹打均匀，磁珠吸附纳米磁珠，去掉上清清洗2次；加入90ul结合缓冲液，1ul封闭液，垂直混合，室温反应60分钟；用磁铁吸附纳米磁珠，去掉上清，加入10ul清洗缓冲液II，清洗I次。加入30ul结合缓冲液，用移液枪吹打混匀，待用；
2、人外周血单核细胞的分离:将采集的新鲜抗凝血与生理盐水1:1稀释后，缓慢加入到等体积的淋巴细胞分离液中离心，离心速度2000rpm，离心20min，将其拿出，并吸取第二层乳白色云雾状的人外周血单核细胞层于装有生理盐水的15mL离心管中洗涤，离心速度1500rpm，离心5min，弃上清，再用生理盐水洗涤I次，将收集到的细胞用10% FBS的1640培养基重悬于细胞培养瓶中；
3、纳米磁珠法筛选呼吸道合胞病毒的记忆性B细胞:加入10ul人外周血单个核细胞，加入前面制备好的30ul纳米磁珠，室温下离心，离心速度180rpm，混合Ih ;用磁铁吸附纳米磁珠，去掉上清，加入10ul清洗缓冲液II，用移液枪吹打混匀；重复上述步骤3次，以充分洗掉非特异性结合的细胞，向细胞-抗体-纳米磁珠复合物中加入30ul结合缓冲液，用移液枪吹打混匀，移至96孔板中镜下观察，显微镜下观察到的与纳米磁珠耦连的细胞即为纳米磁珠筛选到的呼吸道合胞病毒的记忆性B细胞。
[0008]本发明的有益效果:采用特异性抗原与抗体相结合的理论，通过包被有人呼吸道合胞病毒抗原蛋白GD和FD的纳米磁珠，特异性地结合针对人呼吸道合胞病毒的记忆性B细胞表面的IgM和IgD，从而从人外周血单核细胞中快速地捕获针对人呼吸道合胞病毒的记忆性B细胞。本发明的优点是:纳米磁珠筛选呼吸道合胞病毒的记忆性B细胞的方法操作简单，分离快速、高效，灵敏度高，适用于针对任何病毒的记忆性B细胞的快速分离，此外，也可全面监测RSV感染者。
【具体实施方式】
[0009]本发明所述制备方法包括下列步骤:
1、连接纳米磁珠和GD和GL抗原蛋白:将呼吸道合胞病毒抗原蛋白GD和FD各20ul分别加入至含有1ul结合缓冲液的纳米磁珠中，室温，垂直混合过夜；用磁铁吸附纳米磁珠，去掉上清，加入10ul清洗缓冲液II，用移液枪吹打均匀，磁珠吸附纳米磁珠，去掉上清清洗2次；加入90ul结合缓冲液，1ul封闭液，垂直混合，室温反应60分钟；用磁铁吸附纳米磁珠，去掉上清，加入10ul清洗缓冲液II，清洗I次；加入30ul结合缓冲液，用移液枪吹打混匀，待用；
2、人外周血单核细胞的分离:将采集的新鲜抗凝血与生理盐水1:1稀释后，缓慢加入到等体积的淋巴细胞分离液中离心，离心速度2000rpm，离心20min，将其拿出，并吸取第二层乳白色云雾状的人外周血单核细胞层于装有生理盐水的15mL离心管中洗涤，离心速度1500rpm，离心5min，弃上清，再用生理盐水洗涤I次，将收集到的细胞用10% FBS的1640培养基重悬于细胞培养瓶中；
3、纳米磁珠法筛选呼吸道合胞病毒的记忆性B细胞:加入10ul人外周血单个核细胞，加入前面制备好的30ul纳米磁珠，室温下离心，离心速度180rpm，混合Ih ;用磁铁吸附纳米磁珠，去掉上清，加入10ul清洗缓冲液II，用移液枪吹打混匀；重复上述步骤3次，以充分洗掉非特异性结合的细胞，向细胞-抗体-纳米磁珠复合物中加入30ul结合缓冲液，用移液枪吹打混匀，移至96孔板中镜下观察，显微镜下观察到的与纳米磁珠耦连的细胞即为纳米磁珠筛选到的呼吸道合胞病毒的记忆性B细胞。
【主权项】
1.纳米磁珠法筛选呼吸道合胞病毒记忆性B细胞的方法，其特征是: A、连接纳米磁珠和GD和GL抗原蛋白:将呼吸道合胞病毒抗原蛋白GD和FD各20ul分别加入至含有1ul结合缓冲液的纳米磁珠中，室温，垂直混合过夜；用磁铁吸附纳米磁珠，去掉上清，加入10ul清洗缓冲液II，用移液枪吹打均匀，磁珠吸附纳米磁珠，去掉上清清洗2次；加入90ul结合缓冲液，1ul封闭液，垂直混合，室温反应60分钟；用磁铁吸附纳米磁珠，去掉上清，加入10ul清洗缓冲液II，清洗I次； 加入30ul结合缓冲液，用移液枪吹打混匀，待用； B、人外周血单核细胞的分离:将采集的新鲜抗凝血与生理盐水1:1稀释后，缓慢加入到等体积的淋巴细胞分离液中离心，离心速度2000rpm，离心20min，将其拿出，并吸取第二层乳白色云雾状的人外周血单核细胞层于装有生理盐水的15mL离心管中洗涤，离心速度1500rpm，离心5min，弃上清，再用生理盐水洗涤I次，将收集到的细胞用10% FBS的1640培养基重悬于细胞培养瓶中； C、纳米磁珠法筛选呼吸道合胞病毒的记忆性B细胞:加入10ul人外周血单个核细胞，加入前面制备好的30ul纳米磁珠，室温下离心，离心速度180rpm，混合Ih ;用磁铁吸附纳米磁珠，去掉上清，加入10ul清洗缓冲液II，用移液枪吹打混匀；重复上述步骤3次，以充分洗掉非特异性结合的细胞，向细胞-抗体-纳米磁珠复合物中加入30ul结合缓冲液，用移液枪吹打混匀，移至96孔板中镜下观察，显微镜下观察到的与纳米磁珠耦连的细胞即为纳米磁珠筛选到的呼吸道合胞病毒的记忆性B细胞。
【专利摘要】纳米磁珠法筛选呼吸道合胞病毒记忆性B细胞的方法，是采用特异性抗原与抗体相结合的理论，通过呼吸道合胞病毒抗原蛋白GD和FD耦联纳米磁珠，然后将分离得到的人外周血单核细胞加入到已经制备好的含纳米磁珠管中，由于人外周血单核细胞中的针对呼吸道合胞病毒的记忆性B细胞表面有IgM和IgD,耦联在纳米磁珠的呼吸道合胞病毒抗原蛋白GD和FD能特异地结合IgM和IgD，从而将针对呼吸道合胞病毒的记忆性B细胞从人外周血单核细胞中分离出来。本发明的优点是：纳米磁珠筛选呼吸道合胞病毒的记忆性B细胞的方法操作简单，分离快速、高效，灵敏度高，适用于针对任何病毒的记忆性B细胞的快速分离，此外，也可全面监测RSV感染者。
【IPC分类】C12N5-0781
【公开号】CN104560873
【申请号】CN201410726313
【发明人】辛洪波, 陈廷涛, 邓侃, 魏强, 胡萍
【申请人】南昌大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月4日