生物法制备茶氨酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物法制备茶氨酸的方法。
【背景技术】
[0002]茶氨酸(L-theanine)，又称:N_乙基-Y -谷氨酰胺，1949年首次从绿茶中分离得到，是茶叶特有的一种氨基酸。茶氨酸不参与蛋白质的合成，以游离形式存在，占茶叶中游离氨基酸总量的40%?70%是绿茶中有效的呈味物质，其含量直接决定茶叶的品质。此夕卜，茶氨酸还具有降血压、抗肿瘤、保护神经、放松、抗抑郁、抗疲劳、提高免疫力、减轻体脂等作用。L-茶氨酸的多种生理功能及良好的稳定性和安全性，因此在食品和医药开发领域得到了广泛的应用。
[0003]茶氨酸的制造方法主要有三种:一是从茶叶中提取的方法，该法受到茶叶资源的限制。二是化学有机合成茶氨酸的方法，这种方法的生成物中包括D、L-型茶氨酸异构体，需要进行拆分才能得到L型产品，使得分离精制操作复杂。三种是利用微生物酶法生产茶氨酸的方法。目前可用于制备茶氨酸的方法主要有:(1)日本太阳化学株式会社发明了两种制造茶氨酸的新方法，一种是使用来自香茅醇假单孢菌GEA的谷氨酰胺酶作用于谷氨酰胺和乙胺，来生产茶氨酸，最高收率可达65%，专利号CN 100510090 C。另一种方法是使用来自芽孢杆菌属，霉菌或酵母中的I种或2种以上微生物的谷氨酰胺酶作用于谷氨酰胺和乙胺衍生物，来生产茶氨酸的方法。该法副产物少而且谷氨酰胺的转化率可达75%，适合工业化生产，专利号CN 1977047 B。(2) 2008年公开了一种利用来自枯草芽孢杆菌的谷氨酰转肽酶生产茶氨酸的方法，该方法安全可靠，但存在着酶粉制备复杂，工艺中涉及使用乙醇的问题，专利号CN 101343618。(3) 2013年公开了一种利用基因工程菌酶法制备茶氨酸的方法，公开号CN 103409475 A。现有方法中，还没有报道工业化生产的工艺路线，尤其是利用硝基还原假单胞菌采用分批添加底物的方法生产茶氨酸的方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种方法简便、易操作，高效的生物法制备茶氨酸的方法。
[0005]本发明的技术解决方案是:
一种生物法制备茶氨酸的方法，其特征是:包括下列步骤:
(O囷体制备:
将硝基还原假单胞菌菌株进行培养；培养条件为:培养温度25?35°C，调节通风量和搅拌转速，控制4h后溶氧大于60%，培养时间10?24小时；培养结束后得到菌液；
(2)收集菌体:
将步骤(I)得到的菌液经过陶瓷膜过滤收集菌体，膜孔径选择0.05?I μ m，得到菌体；或将步骤(I)得到的菌液经过离心机离心得到菌体；备用；
(3)生产茶氨酸:
配制10?50mmol/L、pH9?10的硼酸-NaOH缓冲溶液，添加0.lmol/L-0.7 mol/L的L-谷氨酰胺和0.2-1.5 mol/L的乙胺盐酸盐，加入0.3-2U/ml的菌体细胞，在25?38°C的条件下反应，每隔4-6 h补加一次0.15mol/L的L-谷氨酰胺，补加1_3次；
(4)脱色:将步骤(3)所得到的清液调pH至5.5?6.8，然后使用活性炭进行脱色处理，收集清液；
(5)膜过滤:将步骤(4)所得到的料液先经过超滤，后经过纳滤，超滤膜孔径50nm左右，纳滤膜孔径100Da左右；
(6)将步骤(5)得到的茶氨酸清液，制成茶氨酸粉剂或茶氨酸晶体产品。
[0006]所述制成茶氨酸粉剂产品的方法依次包括下列步骤:
(1)真空浓缩:采用三效板式蒸发器进行浓缩，当步骤(5)得到的茶氨酸清液浓缩至茶氨酸含量> 80g/L时，停止浓缩，收集浓缩液；
(2)喷雾干燥:在浓缩液中添加麦芽糊精或淀粉，调节固形物质量含量为10?40%，进行喷雾干燥，制得质量含量为20%?80%的茶氨酸粉剂产品。
[0007]所述制成茶氨酸晶体产品的方法:
结晶采用等电点降温结晶法，将步骤(5)得到的茶氨酸清液进行降温结晶或添加乙醇结晶，添加比例为乙醇:料液=0?10: lv/v ;结晶时调节溶液pH至茶氨酸的等电点5.6，温度降温范围为90?5°C，晶种的添加量为0.2?10g/L，搅拌速率为30?100r/min，降温速率为I?8°C /h。
[0008]本发明利用游离硝基还原假单胞菌催化合成茶氨酸，并改进生产工艺，使茶氨酸产量提高，成本降低，而且还建立了制备高纯度茶氨酸的方法。本工艺中反应体系里不含有碳源、氮源等培养基成分，相对于发酵液而言反应液成分简单，可大幅度提高产品纯度，同时具有后处理简单、生产周期短及环境污染小、成本低等优点。
【附图说明】
[0009]下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0010]图1是L-茶氨酸晶体的扫描电镜图。
[0011]图2是L-茶氨酸晶体产品的质谱图。
【具体实施方式】
[0012]实施例1:
(1)菌体培养
硝基还原假单胞菌菌种经活化后，进行一级种子培养，二级种子培养，最后进入发酵罐培养，接种量3% (V/V，种子液/发酵液)，30°C，搅拌速度控制为130rpm，通风量20m3/h，4小时开始调节搅拌转速及通风量以维持溶氧不低于60，培养18小时，通过离心收集菌体。
[0013]种子培养基原料(以g/L计):葡萄糖15、酵母抽提物1、谷氨酸钠10、MgS04.7H20
0.5、K2HP04 0.5，KH2P04 0.5，EDTA-Fe 0.1，消泡剂 0.2，pH 7.3
发酵培养基原料(以g/L计):葡萄糖15、酵母抽提物1、谷氨酸钠10、MgS04 -7H20 0.5、K2HP04 0.5，KH2P04 0.5，EDTA-Fe 0.1，消泡剂 0.2，pH 7.3
(2)生产茶氨酸
采用硝基还原假单胞菌细胞转化法生产茶氨酸，反应条件为:配制0.05mol/L pH9的硼砂缓冲液，加入73g/L谷氨酰胺、122g/L乙胺盐酸盐，加入2U/mL菌体细胞，6 h补加20g/L谷氨酰胺，反应时间为12h。结束后通过离心去除菌体，收集清液，得到含量达62g/L的茶氨酸转化液。
[0014](3)茶氨酸的含量的检测
将上述转化液离心后稀释2?20倍，加入等体积100g/L的三氯乙酸，震荡摇匀，再离心(10，000X g，5min)，再经过0.45 μ m膜过滤，进行高效液相分析。采用ODS C18，40°C分析，茶氨酸用外标法定量。
[0015](4)产品制备:
去除菌体:将得到的茶氨酸转化液经离心机离心去除菌体细胞，得到清液；
脱色:将得到的清液PH调至5.0?7.0，然后经过颗粒活性炭柱进行脱色处理，收集清液；
膜过滤:将脱色后的清液先经过超滤去除大分子物质，超滤膜孔径50nm左右，后经过纳滤，纳滤膜孔径100Da左右；
将膜过滤后的茶氨酸清液，采用等电点降温结晶法制成茶氨酸晶体产品:
结晶时调节溶液PH至茶氨酸的等电点5.6，乙醇添加比例为，乙醇:料液=2:lv/v，温度降温范围为90?5°C，晶种的添加量为2g/L，搅拌速率为50r/min，降温速率为2V /h。
[0016]实施例2:
所述制成茶氨酸粉末产品的方法是:将实施例1步骤(4)得到的膜过滤后的茶氨酸清液，经过以下处理:
(O真空浓缩:采用三效板式蒸发器进行浓缩，待料液浓缩至茶氨酸含量为> 80g/L时，停止浓缩，收集浓缩液。
[0017](2)喷雾干燥:在浓缩液中添加麦芽糊精，调节固形物质量含量为30%，进行喷雾干燥，制得质量含量为50%的茶氨酸粉剂产品。
【主权项】
1.一种生物法制备茶氨酸的方法，其特征是:包括下列步骤: (1)囷体制备: 将硝基还原假单胞菌菌株进行培养；培养条件为:培养温度25?35°C，调节通风量和搅拌转速，控制4h后溶氧大于60%，培养时间10?24小时；培养结束后得到菌液； (2)收集菌体: 将步骤(I)得到的菌液经过陶瓷膜过滤收集菌体，膜孔径选择0.05?I μ m，得到菌体；或将步骤(I)得到的菌液经过离心机离心得到菌体；备用； (3)生产茶氨酸: 配制10?50mmol/L、pH9?10的硼酸-NaOH缓冲溶液，添加0.lmol/L-0.7 mol/L的L-谷氨酰胺和0.2-1.5 mol/L的乙胺盐酸盐，加入0.3-2U/ml的菌体细胞，在25?38°C的条件下反应，每隔4-6 h补加一次0.15mol/L的L-谷氨酰胺，补加1_3次； (4)脱色:将步骤(3)所得到的清液调pH至5.5?6.8，然后使用活性炭进行脱色处理，收集清液； (5)膜过滤:将步骤(4)所得到的料液先经过超滤，后经过纳滤，超滤膜孔径50nm左右，纳滤膜孔径100Da左右； (6)将步骤(5)得到的茶氨酸清液，制成茶氨酸粉剂或茶氨酸晶体产品。
2.根据权利要求1所述的生物法制备茶氨酸的方法，其特征是:所述制成茶氨酸粉剂产品的方法依次包括下列步骤: (1)真空浓缩:采用三效板式蒸发器进行浓缩，当步骤(5)得到的茶氨酸清液浓缩至茶氨酸含量> 80g/L时，停止浓缩，收集浓缩液； (2)喷雾干燥:在浓缩液中添加麦芽糊精或淀粉，调节固形物质量含量为10?40%，进行喷雾干燥，制得质量含量为20%?80%的茶氨酸粉剂产品。
3.根据权利要求1所述的生物法制备茶氨酸的方法，其特征是:所述制成茶氨酸晶体产品的方法: 结晶采用等电点降温结晶法，将步骤(5)得到的茶氨酸清液进行降温结晶或添加乙醇结晶，添加比例为乙醇:料液=0?10: lv/v ;结晶时调节溶液pH至茶氨酸的等电点5.6，温度降温范围为90?5°C，晶种的添加量为0.2?10g/L，搅拌速率为30?100r/min，降温速率为I?8°C /h。
【专利摘要】本发明公开了一种生物法制备茶氨酸的方法，包括菌体制备、细胞转化、脱色、电渗析、制成茶氨酸粉剂产品或茶氨酸晶体产品等步骤。本发明利用游离硝基还原假单胞菌催化合成茶氨酸，采用分批添加底物的方法，使茶氨酸产量提高，成本降低，实现了高浓度反应。本工艺酶反应体系里不含有碳源、氮源等培养成分，相对于发酵液而言反应液成分简单，可大幅度提高产品纯度，同时具有酶源与反应液易分离，后处理简单、生产周期短、产量高、环境污染小及成本低等优点。
【IPC分类】C12R1-38, C12P13-04
【公开号】CN104561160
【申请号】CN201410800930
【发明人】帅玉英, 孙怡, 吴晓花, 顾钦青, 沈宇峰
【申请人】南通励成生物工程有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月22日