一种采用非溶剂脱脂制备脑蛋白水解物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药品和保健食品领域，特别涉及一种脑蛋白水解物的制备方法。
【背景技术】
[0002] 脑蛋白水解物是将动物脑组织经酶水解后获得的一种活性多肽，能以多种方式作 用于中枢神经，调节和改善神经元的代谢，促进突触的形成，诱导神经元的分化，并进一步 保护神经细胞免受各种缺血和神经毒素的损害。
[0003] 脑蛋白水解物的基本生产工艺如下；动物脑组织去除表面的粘膜及血渍后，加水 匀浆，脱脂，胃蛋白酶酶解，胰蛋白酶酶解，超滤。
[0004] 此工艺中脱脂并非必须步骤，脑组织匀浆后亦可直接进行酶解，例如中国专利 200410073403. 5、201110227333. 4,不脱脂直接酶解有三大缺陷，一是大量脂肪包裹蛋白未 被水解，水解液活性肽收率和含量下降，同时产品中混有大分子量致敏物质；二是产品脂肪 含量较高，影响产品稳定性和外观；三是后续工序过滤困难。
[0005] 因此，对脑组织匀浆液进行脱脂有助于提高产品质量和收率，丙酮或丙酮复合 溶剂脱脂是最常见的脱脂方式，例如中国专利200410043939. 2,94104516. 1，这种脱脂方 式的危害是大量使用有机溶剂，造成环境危害和溶剂残留。为避免溶剂脱脂，中国专利 201310113215. X使用乳脂分离机加硅藻土的方式进行脱脂，避免了有机溶剂的使用，但这 种方式脱脂造成活性多肽收率下降并增加设备投入成本。中国专利201210242784. X使用 二氧化碳超临界萃取方式脱脂，不造成环境危害，但超临界萃取设备庞大，价格高昂，产量 极低，限制了工业化应用。
[0006] 此外，采用现有技术中生产工艺所制备脑蛋白水解液含氮量低，国家药品标准 WS1-XG-025-2000规定，干燥后物质含氮量为8 % -10 %，换算成氨基酸+多肽含量在60% 左右，40 %的未知非氨基酸+多肽类物质造成的潜在临床风险可想而知，因此国家食品药 品监督管理局对此类产品的标准在不断提高，逐步淘汰落后产品。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种脑蛋白水解物的制备方法。其 包括以下步骤：（1)组织匀浆；（2)脱脂；（3)清洗过滤；(4)胃蛋白酶酶解；（5)胰蛋白酶酶 解；(6)超滤。
[0008] (1)组织匀浆：冷冻或新鲜哺乳动物脑，清洗，加水匀浆；
[0009] (2)脱脂：上述匀浆液中加入磷脂酶和脂肪酶进行酶解，可以分步进行酶解，亦可 同时加入进行酶解，这两种酶的用量分别为脑重量的0. 1%。?2. 0%。，酶解温度4°C -40°C， 酶解时间〇. 5-5小时。优选的，每种酶用量为脑重量的1%。，温度30°C，酶解时间I. 5小时。
[0010] (3)清洗过滤：将步骤（2)所得酶解液过滤，滤饼加入酶解液2-20倍重量水，水温 4°C -40°C，搅拌10min-60min，过滤，同法清洗3次。优选的，使用3倍量水，水温保持20°C 左右。
[0011] (4)胃蛋白酶酶解：将步骤⑶所得滤渣加水匀衆，盐酸调整pH = 1-3,升温至 35°C -45°C，加入脑重量1%?3%的胃蛋白酶，搅拌，水解10-20小时，冷却，过滤，得胃酶水 解液；优选的，调节pH = 2，温度40 °C，加入脑重量1. 5 %的胃蛋白酶，水解15小时。
[0012] (5)胰蛋白酶酶解：将步骤（4)胃酶水解液用NaOH调整pH = 7-9,升温至 40°C -60°C，加入脑重量1 %?3%的胰蛋白酶酶解，搅拌，水解2-10小时，完毕加热微沸 IOmin灭活，冷却，过滤，得胰蛋白酶水解液；优选的，调节pH = 7. 6?8. 0,温度45°C，加入 2%脑重量的胰蛋白酶，水解5小时。
[0013] (6)超滤：将步骤（5)所得酶解液，调节pH值至中性（6. 5-7. 5)，用截留分子量为 10000道尔顿的超滤器进行超滤，收集分子量小于10000道尔顿的液体，所得超滤液即脑蛋 白水解物。
[0014] 本发明所述的哺乳动物系指人除外的其他哺乳动物，包括猪、牛、马、羊、兔、狗等， 优选猪、牛、羊。步骤（2)所用的磷脂酶包括动物性磷脂酶、微生物磷脂酶，脂肪酶包括动物 性脂肪酶、脂蛋白脂肪酶、微生物脂肪酶。
[0015] 本发明进一步要求保护本发明的脑蛋白水解物与一种或多种载体和/或稀释剂 制的药物及保健品组合物，可以制成市场上可接受的任一剂型。
[0016] 用于口服时，可制成常规的固体制剂，如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂等，也可制成 口服液体制剂，如口服溶液剂、口服混悬剂、糖浆剂等。制成口服制剂时，可以加入适宜的填 充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等。用于肠胃外给药时，可制成注射剂，包括注射液、注射用无 菌粉末与注射用浓溶液。制成注射剂时，可采用现有制药领域中的常规方法生产，配制注射 剂时，可以不加入附加剂，也可根据药物的性质加入适宜的附加剂。
[0017] 本发明进一步要求保护本发明的脑蛋白水解物在制备治疗和/或预防脑功能障 碍的药物和/或保健品中的应用。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
[0019] (1)本发明选用磷脂酶和脂肪酶处理脑组织，首先通过磷脂酶破坏脂肪细胞外层， 再由脂肪酶水解脂肪，所得脑蛋白水解物无溶剂残留，脱脂彻底，活性多肽收率高，酶解液 过滤容易，无需添加设备，费用低廉，适合工业化生产。
[0020] (2)本发明解决脑组织脱脂问题的同时，意外的发现，本发明所采用的脱脂方式有 助于提高最终产品的多肽含量，本发明较现有技术产品氮含量提高50%以上，有效降低产 品临床或日常使用的风险。
【具体实施方式】
[0021] 下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性 的，不能以此限定本发明的保护范围。
[0022] 比较实施例1
[0023] 分别采用不同脱脂方式进行实验，比较最终产品收率、活性多肽含量、过滤难易、 溶剂残留、脂肪含量。步骤如下：
[0024] (1)猪脑匀浆；（2)脱脂；(3)胃蛋白酶酶解；(4)胰蛋白酶酶解；（5)超滤，即得。
[0025] 步骤（2)中采用的脱脂方式及对应获得的产品如表中所示：
[0026]
【主权项】
1. 一种脑蛋白水解物制备方法，包括如下步骤： (1) 组织匀浆； (2) 脱脂； (3) 清洗过滤； (4) 胃蛋白酶酶解； (5) 胰蛋白酶酶解； (6) 超滤。其特征在于，步骤（2)所述的脱脂采用磷脂酶和脂肪酶进行酶解。
2. 根据权利要求1所述的脑蛋白水解物的制备方法，其特征在于，所述磷脂酶的用量 为脑重量的〇. 1%。?2. 0%。，所述脂肪酶的用量为脑重量的0. 1%。?2. 0%。。
3. 根据权利要求2所述的脑蛋白水解物的制备方法，其特征在于，所述磷脂酶的用量 为脑重量的1%。，所述脂肪酶的用量为脑重量的1%。。
4. 根据权利要求1所述的脑蛋白水解物的制备方法，其特征在于，磷脂酶和脂肪酶同 时加入进行酶解。
5. 根据权利要求1所述的脑蛋白水解物的制备方法，其特征在于，磷脂酶和脂肪酶分 别加入进行酶解。
6. 根据权利要求4或5所述的脑蛋白水解物的制备方法，其特征在于，酶解温度为 35°C?50°C，酶解时间0. 5?5小时。
7. 根据权利要求6所述的脑蛋白水解物的制备方法，其特征在于，酶解温度30°C，酶解 时间1. 5小时。
8. 根据权利要求1所述的脑蛋白水解物的制备方法，其特征在于，所述步骤（3)条件 为：每次清洗水用量为脑重量2?20倍，搅拌时间IOmin?60min，温度4°C?40°C ;所述 步骤（4)条件为：胃蛋白酶用量1 %?3 %，pH值为1?3，酶解温度为35 °C?45 °C，酶解时 间10?20hr ;所述步骤（5)条件为：胰蛋白酶用量1%?3%，pH值为7?9,优选pH值为 7. 8,酶解温度为40°C?60°C，，酶解时间2-10hr ;所述的步骤（6)过程中，用相对截留分子 量为10000道尔顿的膜超滤。
9. 一种脑蛋白水解物，其特征在于，该脑蛋白水解物是根据权利要求1-8中任意一项 所述的方法制备得到的。
10. 根据权利要求9所述的脑蛋白水解物制剂，其特征在于，其剂型为口服固体制剂或 者注射剂。
11. 前述权利要求所述的脑蛋白水解物，其制剂剂型可为口服和注射剂。
【专利摘要】本发明公开一种采用非溶剂脱脂制备脑蛋白水解物的方法，包括(1)组织匀浆；(2)脱脂；(3)清洗过滤；(4)胃蛋白酶酶解；(5)胰蛋白酶酶解；(6)超滤。所述的脱脂方式为采用磷脂酶和脂肪酶进行酶解，解决了现有方法使用有机溶剂脱脂造成溶剂残留和环境危害的问题，同时意外的解决了脑蛋白水解液多肽含量低问题，本方法所得水解液多肽含量达90％以上，符合国家标准。
【IPC分类】A61K38-01, C07K1-34, C12P21-06, A23L1-29, A61P25-00
【公开号】CN104561204
【申请号】CN201410776108
【发明人】林波, 王欣, 宫晓辉, 于秀玲, 孔新颖, 韩风雨
【申请人】内蒙古天奇生物科技有限公司, 内蒙古天奇中蒙制药股份有限公司, 内蒙古天奇药业投资（集团）有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月10日