利用诱导损伤结合全基因组深度测序预测细胞成瘤性新方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用诱导损伤结合全基因组深度测序预测细胞成瘤性的方法。
【背景技术】
[0002]因机体外部或内部环境的影响，体细胞内基因组时刻遭受着多种损伤。基因组DNA受损伤后，机体有一套完整的损伤修复方式来修复这些损伤，比如:光复活、切除修复、重组修复等。如果DNA损伤修复功能有缺陷，会导致两种结果:一是细胞会通过凋亡途径来诱导受损伤细胞死亡；二是受损伤的细胞发生基因突变而继续存活。在第二种情况下，随着细胞内基因突变数的积累，正常的体细胞逐渐恶化为肿瘤细胞，进而诱发癌症。
[0003]癌症的早期诊断对其成功治愈具有重要作用，然而长期以来肿瘤的早期诊断标记较少。为了寻找一种更全面且可应用于多种癌症的诊断方法，且基于基因突变积累是导致肿瘤发生的关键因素，发明人提出了一种利用诱导损伤结合全基因组深度测序来预测靶细胞或组织成瘤性的风险的方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种可广泛应用于预测成瘤性的方法。
[0005]为了达到上述目的，一方面，本发明提供一种预测细胞成瘤性的方法，其特征在于:
[0006]检测靶细胞损伤修复后基因组的稳定性和突变情况；
[0007]通过鉴定损伤修复后有无较多新增点突变，进而预测靶细胞的成瘤性，评估靶细胞发展成肿瘤的可能性。
[0008]其中，所述损伤为低剂量辐射处理，优选采用6tlCo进行低剂量辐射处理。
[0009]其中，所述低剂量为4Gy。
[0010]其中，所述修复的时间为4小时。
[0011]其中，所述检测为全基因组深度测序。
[0012]其中，所述检测为检测靶细胞中基因组的变异。
[0013]其中，所述的变异包括点突变和小片段插入与缺失。
[0014]其中，所述评估是通过与相对应的正常细胞相比，检测靶细胞中是否存在较多辐射所引起的点突变或小片段插入与缺失。
[0015]其中，若存在新增变异，且数量较多，说明其基因组稳定性较差，所述靶细胞存在潜在的成瘤性。
[0016]具体地，本发明提供一种利用诱导损伤结合全基因组深度测序的方法来预测细胞基因组稳定性，进而预测其成瘤性高低的方法。
[0017]本发明中所涉细胞系包括小鼠成纤维细胞、小鼠胚胎干细胞及小鼠诱导多功能干细胞。所使用的方法包括通过低剂量照射三种细胞系，检测其照射前后DNA损伤修复能力及其基因组稳定性。
[0018]优选地，所述低剂量辐射处理为通过6tlCo进行低剂量辐射处理。
[0019]优选地，所述低剂量为4Gy。
[0020]优选地，低剂量照射后，细胞培养时间为4小时。
[0021]通过以下分子生物学方法鉴定三种细胞系DNA损伤修复能力的高低:
[0022]分别检测了三种细胞系照射前后其各自细胞核内γΗ2ΑΧ的水平(在受同等损伤情况下，γ Η2ΑΧ的表达水平越高，其DNA损伤修复能力越高)。发明人发现三种细胞在低剂量照射后，小鼠成纤维细胞和小鼠胚胎干细胞中γΗ2ΑΧ水平较照射前有明显的提升，且高于小鼠诱导多功能干细胞，说明小鼠成纤维细胞和小鼠胚胎干细胞具有较高的DNA损伤修复能力来维持基因组的稳定性，而小鼠诱导多功能干细胞则具有较低损伤修复能力。
[0023]通过以下高通量测序方法鉴定三种细胞系基因组稳定性的高低:
[0024]利用第二代高通量测序技术，分别对照射前后的三种细胞系，共6个样本进行了全基因组深度测序。以每种细胞系照射前的测序结果作空白对照，寻找照射后新产生的基因组变异。若基因组变异越多，说明其基因组稳定性越差。反之，则基因组稳定性越高。
[0025]细胞中DNA损伤修复能力、基因组稳定性及其成瘤性的关系:
[0026]所涉及的三种细胞系中，小鼠诱导多能性干细胞较其他两种细胞在体内具有较高的成瘤性，而其较差的基因组稳定性是其成瘤性高的一个重要原因。因此，通过全基因组深度测序来检验细胞的基因组稳定性，进而预测其致癌性是一种适用可行的方法。
[0027]该方法的检测手段是直接通过检测细胞损伤修复后基因突变情况来预测其成瘤性的高低。因此，相对于其它检测基因组稳定性的方法，如免疫荧光等，该方法简便易行，适用于癌症在发生前的检测。且随着高通量测序技术成本的降低，特别是成本更低的第三代测序技术的上市，能够在一天内完成全部基因组测序，而且所需花费不到1000美元，该方法的可用性也随之增加，同时也为未来的精准化个体医疗提供了一定的理论基础。此外，利用此方法，还可通过抽取机体中血液，通过检测其在照射后新增突变数的多少来判断其个体基因组稳定性，进而预测其患癌的风险。
[0028]有益效果:
[0029]本发明利用DNA损伤诱导结合高通量测序，提供了一种可广泛用于提前预测多种癌症的新方法。本方法可以取任何人体样本预先处理评估正常人的癌症风险，较目前只能在已经发生癌变阶段进行免疫和分子检测，具有不可替代的优越性。此外高通量测序成本的降低，尤其是最近低成本第三代高通量测序技术的上市，使该方法的实用性和领先性得到保障。本发明的方法可以有效用于癌症的早期快速诊断。
【附图说明】
[0030]图1显示诱导多能干细胞DNA损伤修复能力低于胚胎干细胞和成纤维细胞。
[0031]图2显示同等剂量辐射造成DNA损伤后，诱导多能干细胞基因组稳定性低于胚胎干细胞和成纤维细胞。
【具体实施方式】
[0032]以下实施例用于举例说明本发明，其并不用于限制本发明。
[0033]实施例1三种细胞系DNA损伤修复能力高低的鉴定
[0034]1.低剂量照射三种细胞系
[0035]I)照射前两天在六孔板中铺盖玻片，并将三种细胞系:小鼠成纤维细胞、小鼠胚胎干细胞及小鼠诱导多功能干细胞传代于铺好盖玻片的六孔板中。
[0036]2)照射前一天更换新鲜培养基。
[0037]3)三种细胞系在同等条件下经过同位素6tlCo放射源、4Gy照射处理。
[0038]2.免疫荧光检测细胞核中γΗ2ΑΧ水平
[0039]I)照射后，将三种细胞系放回二氧化碳培养箱中继续培养4小时。
[0040]2) 4小时后，倒去培养基，并用PBS缓冲液清洗3次。
[0041]3) 4%甲醛室温固定10分钟，并用PBS缓冲液清洗I次。
[0042]4)冰上通透 10 分钟(通透液:0.05% TritonX-100,0.5% ΝΡ-40)，并用 PBS 缓冲液清洗3次。
[0043]5)用2%胎牛血清室温封闭I小时。
[0044]6) 一抗室温孵育 I 小时(γ Η2ΑΧ 抗体:1:500 ；Millipore, CA, USA)，并用 PBST 缓冲液清洗3次。
[0045]7) 二抗室温孵育 I 小时(抗鼠抗体:1:800，Abeam, Cambridge, MA, USA)，并用 PBST缓冲液清洗3次。
[0046]8)封片，使用共聚焦显微镜(Leica TCS SP5)观测。
[0047]实验结果
[0048]在低剂量照射后，与小鼠成纤维细胞和胚胎干细胞相比，小鼠诱导多功能干细胞中YH2AX水平上升不明显，说明其较低的DNA损伤修复能力可能导致其基因组的不稳定性(见图1)。
[0049]实施例2全基因组深度测序检测基因组稳定性
[0050]1.细胞DNA的提取
[0051]I)照射4小时后(同上实验例步骤I)，用PBS缓冲液清洗I次，用细胞刮直接收取小鼠成纤维细胞；使用明胶重悬法收取小鼠胚胎干细胞及诱导多能性干细胞。
[0052]2)使用 DNA 提取试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit, QIAGEN, Germany)提取各细胞系DNA0
[0053]2.文库构建
[0054]I)用 DNA 片段化仪器(Covaris S220，Life Technologies)将 5 微克 DNA 随机打断成300 - 500bp的片段。
[0055]2)末端补平。
[0056]3)片段两端加接头。
[0057]4) PCR 扩增。
[0058]3.上机测序
[0059]构建好的文库经质检后，使用HiSeq2000 (Illumina)进行检测。
[0060]4.测序数据分析
[0061]I)将原始fastq数据进行去接头、去低质量处理。
[0062]2)使用bwa软件将处理过的数据与小鼠参考基因组进行比对。
[0063]3)使用samtools软件筛选各细胞系的变异。
[0064]4)使用VarScan软件对比各细胞系照射前后的差异，找出由照射所引起的基因组变异。
[0065]实验结果
[0066]在低剂量照射后，小鼠诱导多功能干细胞中照射所引起的点突变和小片段插入数量远大于其他两种细胞系(见图2)。说明小鼠诱导功能干细胞的基因组稳定性远低于小鼠成纤维细胞和胚胎干细胞，揭示了其在体内较高致癌性的重要原因。
[0067]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种预测细胞成瘤性的方法，其特征在于: 检测靶细胞损伤修复后基因组的稳定性和突变情况； 通过鉴定损伤修复后有无较多新增点突变，进而预测靶细胞的成瘤性，评估靶细胞发展成肿瘤的可能性。
2.根据权利要求1所述的方法，所述损伤为低剂量辐射处理，优选采用6tlCo进行低剂量福射处理。
3.根据权利要求1或2所述的方法，所述低剂量为4Gy。
4.根据权利要求1所述的方法，所述修复的时间为4小时。
5.根据权利要求1所述的方法，所述检测为全基因组深度测序。
6.根据权利要求1或5所述的方法，所述检测为检测靶细胞中基因组的变异。
7.根据权利要求6所述的方法，所述的变异包括点突变和小片段插入与缺失。
8.根据权利要求7所述的方法，所述评估是通过与相对应的正常细胞相比，检测靶细胞中是否存在较多辐射所引起的点突变或小片段插入与缺失。
9.根据权利要求8所述的方法，其中若存在新增变异，且数量较多，说明其基因组稳定性较差，所述靶细胞存在潜在的成瘤性。
【专利摘要】本发明涉及一种预测细胞成瘤性的方法，所述方法通过诱导靶细胞DNA损伤，经一定时间修复后，检测靶细胞基因组的稳定性和突变情况，进而预测其成瘤性的高低。所述检测是通过高通量全基因组深度测序技术进行判断。所述判断的标准是检测DNA损伤修复后新增突变数量的多少，如果与正常细胞相比突变数量明显增多，则说明靶细胞具有潜在成瘤性。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104561347
【申请号】CN201510037304
【发明人】孙英丽, 张敏杰
【申请人】中国科学院北京基因组研究所
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月23日