运用大肠杆菌作为生物反应器生产重组的抗肿瘤19肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及到生物制药领域，具体涉及运用大肠杆菌作为生物反应器生产重组的抗肿瘤19肽的方法。
【背景技术】
[0002]抗肿瘤19肽为肿瘤抑素(tumstatin)靠近C端的185 — 203位氨基酸，具有直接抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡的作用。当Tumstatinl85 — 203作为Tumstatin整体中的一个部分时，就失去了抑制肿瘤细胞增殖的功能，只有在切去该肽段其他多余的片断时，它的作用才能表现出来。
[0003]抗肿瘤19肽含有α 3链特有的3联体氨基酸序列SNS，可以抑制多形核白血病细胞活化，促进多种肿瘤细胞的黏附和趋化作用，同时能抑制肿瘤细胞的增殖。Shahan等的研宄表明，接近c端185 - 203位氨基酸组成的19肽可抑制黑色素瘤细胞和其他上皮肿瘤细胞以及多形核白血病细胞的生长。
[0004]其具有突出的抑制毛细血管内皮细胞增殖、诱导内皮细胞凋亡和特异性抑制血管生成的活性，进而抑制肿瘤生长，因此把该功能命名为肿瘤抑素。19肽具有较强的直接抗肿瘤活性，有可能成为肿瘤治疗的一种新的有前景的药物。
[0005]肿瘤抑素活性肽分子量小、使用安全、易提取、纯化。研宄发现肿瘤抑素抗肿瘤细胞生长活性区位于19个氨基酸，分子量较小，可以合成这段肽基因序列，通过在原核细胞中大量表达，优化表达条件，得到所需要的大量蛋白，应用到肿瘤治疗中。小分子多肽可以降低对机体的毒副作用和过敏反应，通过原核表达容易获得。
[0006]肿瘤抑素作为肺一肾出血综合症自身抗原可能对肾、肺和机体的其它器官造成一定的损害，早期的研宄限于对肾一肺出血综合征的诊断和治疗，肿瘤抑素对肿瘤抑制作用的发现又赋予了其新的价值，研宄表明肿瘤抑素的抗原表位位于N端的40个氨基酸，这段序列没有抗肿瘤作用。而19肽(185 — 203)的活性区去除了这部分无意义序列，降低了其对机体的副作用，却不影响本身的抗肿瘤活性。可以直接抑制肿瘤细胞增殖和转移，促进肿瘤细胞的凋亡。它具有传统药物的直接作用于肿瘤细胞本身。是一种广谱，低毒，无毒副作用、无耐药性内源性抗肿瘤的药物，为肿瘤治疗提供了更为广阔的前景。而目前的工艺方法来生产重组的抗肿瘤19肽存在产量小，效率低，成本高，不稳定等缺点。
【发明内容】
[0007]针对以上存在的问题，本发明的目的在于提供一种运用大肠杆菌作为生物反应器生产重组的抗肿瘤19肽的方法，本方法生产重组的抗肿瘤19肽产量大，效率高，成本低，生产过程稳定。
[0008]本发明采用的技术方案如下:
[0009]一种运用大肠杆菌作为生物反应器生产重组的抗肿瘤19肽的方法，其特征在于，包括以下三个步骤:
[0010]I)将人工合成肿瘤抑素中185 - 203位氨基酸(19肽)所对应的核苷酸序列，连接至融合蛋白表达载体上；
[0011]2)经过进一步酶切和测序鉴定后，转化到大肠杆菌中进行诱导表达得到融合蛋白；
[0012]3)表达的融合蛋白经几丁质亲和层析、二硫苏糖醇(DTT)的柱内还原，可以直接获得抗肿瘤19肽。
[0013]所述步骤I中表达载体为pet32a。
[0014]所述步骤2中大肠杆菌种类为BL21(DE3)plysS、BL21(DE3)、BL21 和 Rosetta(DE3)中的至少一种，所述诱导表达的诱导剂为乳糖和IPTG中的至少一种，培养基的pH为5 — 9，接种量为I 一 10%，诱导剂的浓度0.05 - 0.5mmol/L，诱导剂添加时间006(|(|为0.5 — 1.0，诱导温度为20 - 70°C，诱导时间2 -1Oho
[0015]本发明的原理如下:
[0016]大肠杆菌是外源蛋白的表达系统中最经典的表达系统，而且是人们了解最透彻的表达系统，并且具有很多优点:成本低，表达量高，繁殖快，易存活，容易操作，抗污染性强，遗传背景清楚，稳定性好，产物易纯化，适应性强，它的这些特性也使它成为高效表达异源蛋白的最常用原核表达系统。大肠杆菌表达系统在基础研宄和商业生产重组蛋白质上是强有力的工具。
[0017]大肠杆菌表达系统是人类了解最深、应用最为广泛的表达系统。它具有发酵时间短和高效合成基因产物的特点。因为大肠杆菌易于操作、发酵成本低、遗传背景清楚等优点，进而成为了外源基因表达的首选。
[0018]大肠杆菌是最经典的原核表达系统，并且是基因表达中的重要工具，具有很多优占.V.
[0019](I)研宄者已经对大肠杆菌的遗传背景和基因表达调控机理研宄的非常透彻。
[0020](2)大肠杆菌的繁殖能力特别强，20min左右就能繁殖一代，从而缩短了发酵时间，利于大规模发酵，而且生产成本低廉。
[0021](3)大肠杆菌表达系统包含有多种宿主菌和载体，可以根据重组蛋白的表达需求进行选择，并且进行最适的搭配。
[0022](4)表达量一般较真核表达系统高，并且下游的工艺比较简单，利于生产，节省了下游的成本。
[0023]4)将合成的抗肿瘤19肽基因连接到表达载体pet32a上，即表达载体pet32a —19肽分别转化到四种大肠杆菌BL21 (DE3)plysS、BL21 (DE3)、BL21和Rosetta (DE3)感受态细胞中，用诱导剂进行诱导表达重组蛋白，将诱导表达出的菌体进行SDS - PAGE蛋白电泳检测，并运用Gel quant Express软件分析凝胶电泳结果，筛选出表达量最高的菌株作为工程菌，对工程菌株进行质粒稳定性进行验证。表达的融合蛋白经几丁质亲和层析、二硫苏糖醇(DTT)的柱内还原，可以直接获得抗肿瘤19肽。利用MTT的方法对重组蛋白进行抗肿瘤能力的研宄。
[0024]本发明的有益效果是:利用大肠杆菌作为生物反应器生产重组的抗肿瘤19肽产量大，效率高，成本低，生产过程稳定。
【具体实施方式】
[0025]实施例1
[0026]将人工合成肿瘤抑素中185 - 203位氨基酸(19肽)所对应的核苷酸序列，连接至融合蛋白表达载体pet32a上；经过进一步酶切和测序鉴定后，转化到BL21 (DE3)plysS大肠杆菌中进行诱导表达得到融合蛋白；诱导剂为乳糖，培养基的PH为6.5，接种量为2.1%,诱导剂的浓度0.lmmol/L,诱导剂添加时间0D_为0.7，诱导温度为50°C，诱导时间5h，表达的融合蛋白经几丁质亲和层析、二硫苏糖醇(DTT)的柱内还原，可以直接获得抗肿瘤19肽。蛋白的表达量高达54.57mg/L，复性后的重组蛋白对肿瘤细胞的抑制率为70%。
[0027]实施例2
[0028]将人工合成肿瘤抑素中185 - 203位氨基酸(19肽)所对应的核苷酸序列，连接至融合蛋白表达载体pet32a上；经过进一步酶切和测序鉴定后，转化到BL21 (DE3)大肠杆菌中进行诱导表达得到融合蛋白；诱导剂为IPTG，培养基的pH为6.5，接种量为2.1 %，诱导剂的浓度0.lmmol/L，诱导剂添加时间0D_为0.7，诱导温度为40°C，诱导时间3h，表达的融合蛋白经几丁质亲和层析、二硫苏糖醇(DTT)的柱内还原，可以直接获得抗肿瘤19肽。蛋白的表达量高达58.51mg/L，复性后的重组蛋白对肿瘤细胞的抑制率为75%。
[0029]实施例3
[0030]将人工合成肿瘤抑素中185 — 203位氨基酸(19肽)所对应的核苷酸序列，连接至融合蛋白表达载体pet32a上；经过进一步酶切和测序鉴定后，转化到BL21 (DE3)plysS大肠杆菌中进行诱导表达得到融合蛋白；诱导剂为IPTG，培养基的pH为6.0，接种量为2.1 %，诱导剂的浓度0.09mmol/L,诱导剂添加时间0D_为0.5，诱导温度为45°C，诱导时间5h，表达的融合蛋白经几丁质亲和层析、二硫苏糖醇(DTT)的柱内还原，可以直接获得抗肿瘤19肽。蛋白的表达量高达56.32mg/L，复性后的重组蛋白对肿瘤细胞的抑制率为65%。
[0031]实施例4
[0032]将人工合成肿瘤抑素中185 - 203位氨基酸(19肽)所对应的核苷酸序列，连接至融合蛋白表达载体pet32a上；经过进一步酶切和测序鉴定后，转化到Rosetta (DE3)大肠杆菌中进行诱导表达得到融合蛋白；诱导剂为乳糖，培养基的PH为7.0，接种量为1.5%，诱导剂的浓度0.08mmol/L,诱导剂添加时间0D_为0.6，诱导温度为50°C，诱导时间4h，表达的融合蛋白经几丁质亲和层析、二硫苏糖醇(DTT)的柱内还原，可以直接获得抗肿瘤19肽。蛋白的表达量高达53.85mg/L，复性后的重组蛋白对肿瘤细胞的抑制率为68%。
【主权项】
1.一种运用大肠杆菌作为生物反应器生产重组的抗肿瘤19肽的方法，其特征在于，包括以下几个步骤: 1)将人工合成肿瘤抑素中185- 203位氨基酸(19肽)所对应的核苷酸序列，连接至融合蛋白表达载体上； 2)经过进一步酶切和测序鉴定后，转化到大肠杆菌中进行诱导表达得到融合蛋白； 3)表达的融合蛋白经几丁质亲和层析、二硫苏糖醇(DTT)的柱内还原，可以直接获得抗肿瘤19肽。
2.根据权利要求1所述的一种运用大肠杆菌作为生物反应器生产重组的抗肿瘤19肽的方法，其特征在于:所述步骤I中表达载体为pet32a。
3.根据权利要求1所述的一种运用大肠杆菌作为生物反应器生产重组的抗肿瘤19肽的方法，其特征在于:所述步骤2中大肠杆菌种类为BL21 (DE3)plysS、BL21 (DE3)、BL21和Rosetta (DE3)中的至少一种，所述诱导表达的诱导剂为乳糖和IPTG中的至少一种，培养基的pH为5 — 9，接种量为I 一 10%，诱导剂的浓度0.05 - 0.5mmol/L，诱导剂添加时间OD6tltl为0.5 — 1.0，诱导温度为20 - 70°C，诱导时间2 — 10h。
【专利摘要】本发明涉及一种运用大肠杆菌作为生物反应器生产重组的抗肿瘤19肽的方法，将人工合成肿瘤抑素中185－203位氨基酸(19肽)所对应的核苷酸序列连接至融合蛋白表达载体上；经过进一步酶切和测序鉴定后，转化到大肠杆菌中进行诱导表达得到融合蛋白；表达的融合蛋白经几丁质亲和层析、二硫苏糖醇(DTT)的柱内还原，可以直接获得抗肿瘤19肽。本发明提供的一种运用大肠杆菌作为生物反应器生产重组的抗肿瘤19肽的方法，生产重组的抗肿瘤19肽产量大，效率高，成本低，生产过程稳定。
【IPC分类】C07K7-08, C12R1-19, C12N15-70
【公开号】CN104593402
【申请号】CN201510030041
【发明人】孙旸, 陈 光, 孙春玉, 迟惠, 王刚, 陈欢, 王聪, 孙宁宁, 张斯童
【申请人】吉林农业大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月21日