一种基于发根农杆菌介导的板栗转基因方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及植物转基因技术，主要涉及一种基于发根农杆菌 介导的板栗转基因方法。
【背景技术】
[0002] 板栗是世界重要的干果类果树之一。目前，在国内，对板栗的研究多集中于生理生 化水平，如果实品质分析等，而关于基因挖掘与功能分析的报道较少；其次对板栗地上部分 的研究较多，如花芽分化等，而对根系的研究较少。对于板栗关键生物学性状的研究，基因 挖掘与功能验证起着不可或缺的作用，而在中国板栗中，转基因体系还未建立，基于转基因 体系的基因功能验证还未见报道。目前缺少一套稳定高效的转基因体系，已经成为制约板 栗分子生物学研究的瓶颈。
[0003]根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens)和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes)均是革兰氏阴性土壤细菌，分别应用其Ti质粒和Ri质粒侵染植物伤口进入 细胞，并将其上含有的一段T-DNA插入到植物基因组中（Zhou，2010 ;Cheng，2011)，发根农 杆菌Ri质粒的T-DNA上有rolA-D基因群，T-DNA有tms基因，能诱发被感染植物的受 伤部位产生大量的毛状根，且Ri质粒T-DNA上的基因不影响植株的再生，转化效率高， 目前已在甘草（GlycyrrhizauralensisFisch.)、烟草（NicotianatabacumL.)等中获得成 功。发根农杆菌诱导的毛状根属于激素自养型，具有有效成分含量高、生理生化和遗传性稳 定、易于进行操作控制等特点，且所诱导的毛状根可从形态水平上鉴定，根多丛生、多分枝、 多根毛，且无向地性，这些都可与未转化的根区别开。
[0004] 目前，板栗转基因还未见报道，因此，对于板栗的遗传改良和基因挖掘与功能分 析，建立一套农杆菌介导的、高效稳定的转基因技术是很必要的。本发明的目的在于利用发 根农杆菌建立'燕山板栗'毛状根诱导体系，从而提供一种基于发根农杆菌介导的转基因方 法。
【发明内容】
[0005] 本发明可以提供一种发根农杆菌介导的转基因方法，获得'燕山板栗'毛状根。
[0006] 本发明所提出的技术方案包括以下步骤：
[0007] (1)制备板栗无菌苗；
[0008] (2)发根农杆菌活化，将发根农杆菌在LB固体培养基上划线，以获得单菌落，挑取 单菌落于LB液体培养基上，经暗培养；
[0009] (3)侵染外植体，将板栗无菌苗下胚轴切除，在伤口处涂抹已活化的发根农杆菌， 然后将其放在共培养基上，经光照培养；
[0010] ⑷共培养；
[0011] (5)发根培养；
[0012] (6)荧光检测。
[0013] 进一步地，其中所述的发根农杆菌为MSU440,载体上具35S: :DsRed报告基因。
[0014] 进一步地，其中步骤（2)中LB固体培养基或者LB液体培养基含50?100mg/L壮 观霉素（spectinomycin)〇
[0015] 进一步地，其中步骤（2)中将发根农杆菌在LB固体培养基上划线，经28±2°C暗处 倒置培养48 - 72h后获得单菌落。
[0016] 进一步地，其中步骤（2)中所述的暗培养系经28±2°C、摇床转速200±20rpm暗培 养 48h。
[0017] 进一步地，其中步骤（3)还包括用沾有农杆菌的针头在板栗无菌苗胚根的伤口及 伤口周围，然后将其放在铺有1/2无菌滤纸的共培养培养基上，Parafilm膜封口 2/3。
[0018] 进一步地，其中步骤（4)的共培养系经21 ±2°C光照16h、暗培养8h，如此反复培养 5d。
[0019] 进一步地，其中步骤（1)包括剥取'燕山红栗'果实种子，清水冲洗干净后用 70-75%乙醇消毒2±lmin，然后3-4%次氯酸钠消毒15-20min，灭菌蒸馏水漂洗3次以上， 接种于木本植物基础培养基（WPM培养基），25 ±2 °C暗培养2 - 3d获得无菌苗。
[0020] 进一步地，其中步骤（5)的继代培养包括将浸染后的外植体从共培养培养基上更 换到发根培养基上，Parafilm膜全封口，24°C?25°C光照16h，暗培养8h，如此反复培养 25d，每周更换一次培养基。
[0021] 进一步地，其中步骤（6)包括采用体视荧光显微镜对共转化植株进行荧光观察。
[0022] 本发明通过发根农杆菌介导的转基因技术，可在短时间内（1个月）得到毛状根， 节约研究时间，并且转化效率较高，可达60%左右（阳性植株总数占总侵染植株总数的百 分比）。
[0023] 具体实施方法：
[0024] 现在结合具体实施例，进一步对本发明各步骤进行详细描述：
[0025] 1、含35S: :DsRed报告体系的表达载体MSU440发根农杆菌：由瓦赫宁根大学Ton Bisseling课题组馈赠。
[0026] 2、'燕山红栗'无菌苗外植体的获得：'燕山红栗'采自北京市怀柔区林业局板栗试 验站，剥取'燕山红栗'果实种子，清水冲洗干净后用70% -75%乙醇消毒2min(摇床上摇 起来即可），然后3-4%次氯酸钠消毒15-20min(摇床上摇起来即可），灭菌蒸馏水漂洗3次 以上，接种于WPM培养基，25±1°C暗培养2 - 3d获得无菌苗；
[0027] 3、发根农杆菌的活化：将发根农杆菌在含50mg/L壮观霉素的LB固体培养基上 划线，28°C暗处倒置培养48 - 72h后获得单菌落，挑取单菌落于新鲜含50mg/L壮观霉素 (spectinomycin)LB液体培养基上，28°C220rpm暗培养48h。吸取菌液再次涂布于含50mg/ L壮观霉素（spectinomycin)的LB固体培养基上，48 - 72h后用于侵染外植体；
[0028] 4、侵染外植体：先将'燕山红栗'无菌苗下胚轴切除，在伤口处涂抹已活化的发根 农杆菌MSU440,再用沾有农杆菌的针头戳其伤口及伤口周围，然后将其放在有铺有1/2无 菌滤纸的共培养培养基上，Parafilm膜封口 2/3。
[0029] 5、共培养：21 ± 1°C光照16小时、暗培养8h,如此反复培养5d。
[0030]6、发根培养：更换到发根培养基上，方法同步骤（4)，Parafilm膜全封口，24°C? 25°C光照16小时、暗培养8h，如此反复，培养25d，每周更换一次培养基。
[0031] 7、荧光检测：利用体视荧光显微镜对共转化植株进行荧光观察，结果表明：转 35S: :DsRed植株根系可见整条根均有较强红色荧光。
[0032] 本发明中主要培养基及试剂如下，其中LB培养基溶解后不调pH值：
[0033] 木本植物基础培养基（WPM培养基）：WPM+3 %蔗糖+0. 7 %琼脂
[0034] 共培养培养基：g/L(参见表1)
[0035]表1
[0036]
【主权项】
1. 一种发根农杆菌介导的板栗转基因方法，其特征在于，包括以下步骤： 制备板栗无菌苗； 发根农杆菌活化，将发根农杆菌在LB固体培养基上划线，以获得单菌落，挑取单菌落 于LB液体培养基上，经暗培养； 侵染外植体，将板栗无菌苗下胚轴切除，在伤口处涂抹已活化的发根农杆菌，然后将其 放在共培养基上，经光照培养； 共培养； 发根培养； 荧光检测。
2. 根据权利要求1所述的发根农杆菌介导的板栗转基因方法，其中所述的发根农杆菌 为MSU440,载体上具35S ::你处请艮告基因。
3. 根据权利要求1所述的发根农杆菌介导的板栗转基因方法，其中步骤（2)中LB固体 培养基或者LB液体培养基含50?100mg/L壮观霉素（spectinomycin)。
4. 根据权利要求1或3中所述的发根农杆菌介导的板栗转基因方法，其中步骤（2)中 将发根农杆菌在LB固体培养基上划线，经28±2°C暗处倒置培养48 - 72h后获得单菌落。
5. 根据权利要求1或3中所述的发根农杆菌介导的板栗转基因方法，其中步骤（2)中 所述的暗培养系经28±2°C、摇床转速200±20rpm暗培养48h。
6. 根据权利要求1所述的发根农杆菌介导的板栗转基因方法，其中步骤（3)还包括用 沾有农杆菌的针头在板栗无菌苗胚根的伤口及伤口周围多次刺穿，然后将其放在铺有1/2 无菌滤纸的共培养培养基上，Parafilm膜封口 2/3。
7. 根据权利要求1所述的发根农杆菌介导的板栗转基因方法，其中步骤（4)的共培养 系经21 ±2°C光照16h、暗培养8h，如此反复培养5d。
8. 根据权利要求1所述的发根农杆菌介导的板栗转基因方法，其中步骤（1)包括剥取 '燕山红栗'果实种子，清水冲洗干净后用70-75%乙醇消毒2±lmin，然后3-4%次氯酸钠消 毒15-20min，灭菌蒸馏水漂洗3次以上，接种于木本植物基础培养基（WPM培养基)，25±2°C 暗培养2 - 3d获得无菌苗。
9. 根据权利要求1所述的发根农杆菌介导的板栗转基因方法，其中步骤（5)的发根 培养包括将浸染后的外植体从共培养培养基上更换到发根培养基上，Parafilm膜全封口， 24°C?25°C光照16h，暗培养8h，如此反复培养25d，每周更换一次培养基。
10. 根据权利要求1所述的发根农杆菌介导的板栗转基因方法，其中步骤（6)包括采用 体视突光显微镜对共转化植株进行突光观察。
【专利摘要】本发明提出了一种基于发根农杆菌介导的板栗转基因方法，利用含35S：：DsRed报告基因的发根农杆菌MSU440侵染北京主栽板栗品种“燕山红栗”无菌苗下胚轴，获得共转化植株，进而得到转化毛状根。采用本发明提出的“燕山红栗”下胚轴转化方法不仅可以大大缩短转化周期（1个月），也可以直观的看到实验结果；以“燕山红栗”离体毛状根体系进行根系发育方面的研究可以人为控制培养条件，消除环境因素带来的影响；此外，该方法可以克服‘燕山红栗’实生苗根系因土壤环境给观察、取样带来的困难，从而有望改变板栗根系研究相对落后的现状。本发明为板栗基因功能验证提供了一种快速可靠的方法，也为板栗基因的遗传改良提供一种新的转化方法。
【IPC分类】A01H5-00, C12N15-84
【公开号】CN104593409
【申请号】CN201510002785
【发明人】曹庆芹, 陈双双, 邢宇, 秦岭, 杨柳, 张卿, 房克凤
【申请人】北京农学院
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月5日