一种用于检测血吸虫的引物、探针和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于检测血吸虫的引物、探针和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 血吸虫（Schistosomiasis)是一种严重危害人类健康的感染性疾，主要分布于东 南亚、南美、非洲和中东等国家和地区，是世界上仅次于疟疾的第二大寄生虫。人体血吸虫 主要包括：日本血吸虫、埃及血吸虫、曼氏血吸虫、间插血吸虫和湄公血吸虫，其中埃及血吸 虫、曼氏血吸虫和日本血吸虫流行最为广泛。
[0003]目前，对血吸虫常用的诊断方法可分为原学诊断和血清学免疫诊断方法两大类。 原学诊断中的粪检法被认为是血吸虫诊断的"金标准"，但由于血吸虫在终宿主体内的寄生 有着特殊的生物学关系，导致在慢性人和低度感染者的粪便中难以查见原体，容易出现漏 检，故不适用于早期诊断。免疫学方法虽然检测敏感性较高，但由于治疗以后血清抗体在很 长一段时间内仍然维持一定的水平，其检测结果难以区分现症感染和既往感染，作为早期 诊断及疗效考核的方法均不理想。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术中针对血吸虫的早期诊断检测不理想的问题，本发明实施例提 供了一种用于检测血吸虫的引物、探针和试剂盒。所述技术方案如下：
[0005] -方面，本发明实施例提供了一种用于检测血吸虫的引物和探针，所述引物和探 针包括：用于检测血吸虫的正向引物、用于检测血吸虫的反向引物和用于检测血吸虫的探 针，其中，
[0006] 所述用于检测血吸虫的正向引物如序列表中SEQIDNO. 1所示；
[0007] 所述用于检测血吸虫的反向引物如序列表中SEQIDNO. 2所示
[0008] 所述用于检测血吸虫的探针如序列表中SEQIDNO. 3所示；
[0009] 所述探针的5'端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、R0X、Cy3或Cy5,所述 探针的 3' 端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQl、BHQ2、BHQ3 或DABCYL。
[0010] 另一方面，本发明提供了一种用于检测血吸虫的试剂盒，所述试剂盒包括上述的 引物和探针。
[0011] 具体地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、PCR反应液、临界阳性质控品、阳性质控 品、阴性质控品和工作标准品。
[0012] 具体地，所述核酸释放剂包括无菌水、终浓度为0. 03-0. 3 %的聚乙二醇辛基苯基 醚、终浓度为〇. 04-0. 4%的壬基酚聚氧乙烯（40)醚和pH值为8. 3的终浓度为0. 01-0. 1M 的三（羟甲基）氨基甲烷。
[0013] 具体地，所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中包括：终浓度为0.01U/ iiL?0? 05U/iiL的Taq酶、终浓度为0? 2?0? 6mM的dNTPs、10XPCR缓冲液和终浓度为 1. 5?5.OmM的含Mg离子的溶液。
[0014] 具体地，所述临界阳性质控品包括含浓度为1.ox104拷贝/mL的血吸虫基因片段 的溶液。
[0015] 具体地，所述正向引物和所述反向引物的终浓度均为0. 05-0. 9ilM，所述探针的终 浓度为 〇? 05-0. 9yM。
[0016] 具体地，所述工作标准品包括：工作标准品1、工作标准品2、工作标准品3和工作 标准品4,其中，
[0017] 所述工作标准品1为含有1.OX107拷贝/mL的埃及血吸虫基因的非传染性DNA片 段；
[0018] 所述工作标准品2为含有1.OX106拷贝/mL的埃及血吸虫基因的非传染性DNA片 段；
[0019] 所述工作标准品3为含有1. OX 105拷贝/mL的埃及血吸虫基因的非传染性DNA片 段；
[0020] 所述工作标准品4为含有1. OX 104拷贝/mL的埃及血吸虫基因的非传染性DNA片 段。
[0021] 具体地，所述阳性质控品包括含浓度为1.ox106拷贝/mL的血吸虫基因片段的溶 液。
[0022] 具体地，所述阴性质控品为浓度0. 8%的生理盐水。
[0023] 本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的用于检测 血吸虫的引物和探针具有灵敏度高的特性，使得本发明实施例提供的用于检测血吸虫的试 剂盒具有灵敏度高的特性，采用仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，其检测结果 可靠，提高了检测的灵敏度，即使仅存在单拷贝的目的片段该试剂盒也可以进行有效的检 测；检测速度快，整个检测过程共仅需2?3小时。
【附图说明】
[0024] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于 本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他 的附图。
[0025] 图1是本发明实施例2提供的荧光扩增曲线图；
[0026] 图2是本发明实施例3提供的荧光扩增曲线图；
[0027] 图3是本发明实施例4提供的荧光扩增曲线图；
[0028]图4是本发明实施例5提供的标准曲线的荧光扩增曲线图；
[0029] 图5是本发明实施例5提供的荧光扩增曲线图；
[0030] 图6是本发明实施例5提供的由图4得到的标准曲线图，图6横坐标为Log StartingQuantitycopynumber,纵坐标为ThresholdCycle。
[0031]图中：Cycles为循环数，RFU为突光值，LogStartingQuantitycopynumber为血 吸虫起始浓度的对数值，Ct(ThresholdCycle)值为循环数；la-实施例2中样品1，4a_实 施例2中样品4, 5a-实施例2中样品5,6a-实施例2中样品6, 7a-实施例2中样品7。
【具体实施方式】
[0032] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明实施方式 作进一步地详细描述。以下实施例中所用试剂和探针主要购自宝生物工程（大连）有限公 司。
[0033] 实施例1.一种用于血吸虫核酸定量检测的引物和荧光探针
[0034] 本发明实施例提供了一种用于检测血吸虫的引物和探针，引物和探针包括：用于 检测血吸虫的正向引物、用于检测血吸虫的反向引物和用于检测血吸虫的探针，其中，用于 检测血吸虫的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所示；
[0035] 用于检测血吸虫的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2所示
[0036] 用于检测血吸虫的探针如序列表中SEQ ID NO. 3所示；
[0037] 探针的5'端连接有荧光基团？411、册乂、了￡1\1(^、￥1(：、1?(?、〇73或〇75，探针的3' 端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQl、BHQ2、BHQ3或DABCYL。在本发明实施例中，探针 的荧光报告基团为FAM，FAM的激发波长为485nm，接收波长为527nm ;淬灭基团为Eclipse。 纯化方式可选自：HAP、PAGE和HPLC纯化方式，具体地引物和探针如下表：
[0038] 表1.血吸虫引物和荧光探针
[0039]
【主权项】
1. 一种用于检测血吸虫的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括：用于检测 血吸虫的正向引物、用于检测血吸虫的反向引物和用于检测血吸虫的探针，其中， 所述用于检测血吸虫的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所示； 所述用于检测血吸虫的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2所示 所述用于检测血吸虫的探针如序列表中SEQ ID NO. 3所示； 所述探针的5'端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5,所述探针 的3'端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。
2. -种用于检测血吸虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的 引物和探针。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、PCR反 应液、临界阳性质控品、阳性质控品、阴性质控品和工作标准品。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸释放剂包括无菌水、终浓度为 0. 03-0. 3%的聚乙二醇辛基苯基醚、终浓度为0. 04-0. 4%的壬基酚聚氧乙烯（40)醚和pH 值为8. 3的终浓度为0? 01-0. 1M的三（羟甲基）氨基甲烷。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应 体系中包括：终浓度为〇. 01U/ ii L?0. 05U/ ii L的Taq酶、终浓度为0. 2?0. 6mM的dNTPs、 10 XPCR缓冲液和终浓度为1. 5?5. OmM的含Mg离子的溶液。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述临界阳性质控品包括含浓度为 1. OX 104拷贝/mL的血吸虫基因片段的溶液。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述正向引物和所述反向引物的终浓 度均为0. 05-0. 9 ii M，所述探针的终浓度为0. 05-0. 9 ii M。
8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述工作标准品包括：工作标准品1、工 作标准品2、工作标准品3和工作标准品4,其中， 所述工作标准品1为含有1.〇X 107拷贝/mL的血吸虫基因的非传染性DNA片段； 所述工作标准品2为含有1. OX 106拷贝/mL的血吸虫基因的非传染性DNA片段； 所述工作标准品3为含有1. OX 105拷贝/mL的血吸虫基因的非传染性DNA片段； 所述工作标准品4为含有1. OX 104拷贝/mL的血吸虫基因的非传染性DNA片段。
9.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品包括含浓度为 1. OX 106拷贝/mL的血吸虫基因片段的溶液。
10.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为浓度0. 8%的生理 盐水。
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测血吸虫的引物、探针和试剂盒，属于生物技术领域。所述引物和探针包括：用于检测血吸虫的正向引物、用于检测血吸虫的反向引物和用于检测血吸虫的探针。所述试剂盒包括所述的引物和探针。本发明实施例提供的用于检测血吸虫的引物和探针，针对检测血吸虫具有灵敏度高的特性，使得本发明实施例提供的用于检测血吸虫的试剂盒，针对检测血吸虫具有灵敏度高的特性；检测速度快，整个检测过程共仅需2～3小时。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104593486
【申请号】CN201410734513
【发明人】刘茹, 桑筱筱
【申请人】湖北永邦医疗科技有限公司
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2014年12月4日