与黄瓜表皮毛发育基因Mict共分离的分子标记的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术，特别涉及与黄瓜表皮毛发育基因Mict共分离的分子 记D 技术背景
[0002] 植物表皮毛（Trichome)是一种结构高度特化的生物学器官，由原表皮细胞发育 而来，是从单细胞水平研宄植物细胞分化，包括细胞命运、细胞周期、细胞极性、细胞形态建 成等方面的理想模型。表皮毛广泛存在于绝大多数植物表面，分为单细胞或多细胞，有腺体 或无腺体，有分枝或无分枝几类。表皮毛在植物的生长发育及对环境的适应等方面，包括生 物或非生物的，起着重要的作用。如增加表皮层厚度以调节体温，减少蒸腾作用水分散失， 降低机械损伤，减少紫外光伤害，保护植物免受昆虫、食草动物及病原菌的侵害，有助于花 粉的收集和传播等。
[0003] 黄瓜（CucumissativusL.)属木兰纲（Magnoliopsida)、萌芦科 (Cucurbitaceae)、甜瓜属（Cucumis)，是一年蔓生草本植物，世界重要蔬菜作物之一，因其 花性型多样，被作为花性型研宄的模式植物。表皮毛广泛分布于黄瓜植株的茎、叶、卷须、花 瓣、萼片、子房表面，黄瓜果实属瓠果，由子房和花托共同发育而成，果实表皮毛形态高度特 化，通常被称作"果刺"。
[0004] 曹辰兴于1997年在华北类型黄瓜地方品种"大青把"自交后代的群体中发现无毛 类型的自然突变体，其表现为茎、叶、卷须、花瓣、萼片、子房表面均无表皮毛，该突变体为黄 瓜表皮毛形成机理研宄提供了理想的材料，也为黄瓜遗传育种提供了无刺亲本。外观光滑 的黄瓜污染少，清洗方便，是无公害蔬菜的理想品种。无瘤少刺的黄瓜果肉农药残留量比有 刺黄瓜低27%，果皮农药残留量低18%。
[0005] 黄瓜表皮毛不同于拟南芥与棉花，是典型的多细胞无分枝表皮毛。目前对于植物 表皮毛的研宄主要集中于拟南芥的单细胞类型，对多细胞表皮毛的研宄尚未深入，黄瓜表 皮毛相关基因的图位克隆及调控机制研宄也未见报道。黄瓜无毛突变体果实无果瘤，且生 殖生长提前，雌花花萼肥大，说明黄瓜表皮毛基因还参与了果瘤的形成及其它发育过程。本 发明对黄瓜表皮毛相关基因图位克隆的初步研宄，不仅可以揭示植物多细胞表皮毛发育的 分子机理，而且能为更多表皮毛相关基因的克隆和功能的研宄奠定基础，并加快黄瓜品质 育种进程。
[0006] 图位克隆（Map-basedcloning)，亦称定位克隆（Positionalcloning)，可在基因 产物未知的情况下，利用分离群体的遗传连锁分析或染色体的异常，将目的基因定位到染 色体的一种具体位置，找到与其紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆基因。最 常用的标记筛选方法是分离体分组混合分析法（Bulkedsegregantanalysis，BSA)，该方 法在一对具有目的基因表型差异的亲本所构建的分离群体中，根据目的基因的表型，分别 选取一定数量的个体，构成两个亚群，将每个亚群中个体的DNA等量混合，形成两个相对性 状的"基因池"（Genepool)，然后用合适的分子标记对两个基因池进行分析，在两池间表现 出多态性的分子标记与目的基因座位相连锁，再利用分离群体进一步检测所得分子标记与 目的基因的连锁程度，从而确定其在已知分子图谱或染色体上的位置。由于构建基因池使 用了特定的分离群体，且在分组时仅对目的基因表型进行选择，这样保证了其他性状的遗 传背景基本相同，两个基因池之间理论上应主要在目的基因区段存在差异，排除了环境及 人为因素的影响，使研宄结果更为准确可靠。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的，就是为了提供三种与黄瓜表皮毛发育基因Mict共分离的分子标 记。
[0008] 为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案：
[0009] -种与黄瓜表皮毛发育基因Mict共分呙的分子标记，命名为 Cosegregated-SNP-01，由序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸片段和SEQ ID NO. 2所示的 核苷酸片段组成，其中SEQ ID NO. 1所示片段与表皮毛发育基因Mict共分离，SEQ ID NO. 2 所示片段与无毛基因mict共分离。
[0010] 上述与黄瓜表皮毛发育基因Mict共分尚的分子标记，其中，所述分子标记 Cosegregated-SNP-01由SEQIDNO.7所示上游引物和SEQIDNO. 8所示的下游引物扩增 得到。
[0011] -种与黄瓜表皮毛发育基因Mict共分尚的分子标记，命名为 Cosegregated-SNP-02,由SEQIDNO. 3所示的核苷酸片段和SEQIDNO. 4所示的核苷酸片 段组成，其中SEQIDNO. 3所示片段与表皮毛发育基因Mict共分离，SEQIDNO. 4所示片 段与无毛基因mict共分离。
[0012] 上述与黄瓜表皮毛发育基因Mict共分尚的分子标记，其中，所述分子标记 Cosegregated-SNP-02由SEQIDNO.9所示上游引物和SEQIDNO.10所示的下游引物扩增 得到。
[0013] -种与黄瓜表皮毛发育基因Mict共分呙的分子标记，命名为 Cosegregated-SNP-03,由SEQIDNO. 5所示的核苷酸片段和SEQIDNO.6所示的核苷酸片 段组成，其中SEQIDNO. 5所示片段与表皮毛发育基因Mict共分离，SEQIDNO.6所示片 段与无毛基因mict共分离。
[0014] 上述与黄瓜表皮毛发育基因Mict共分尚的分子标记，其中，所述分子标记 Cosegregated-SNP-03由SEQIDNO.11所示上游引物和SEQIDNO.12所示的下游引物扩 增得到。
[0015] 本发明是通过图位克隆的方法，利用黄瓜无毛突变体（mict)和有毛（Mict)野生 型（S77)配制杂交组合，F1代自交产生F2代群体，共7936株个体，并鉴定叶片有毛和无毛 表型，其中有毛个体5904株，无毛个体2032株，每株取一片嫩叶提取基因组DNA，结合BSA 法筛选与Mict基因共分离的分子标记，经双脱氧链终止法测序得到的。
[0016] 本发明中与黄瓜表皮毛发育基因Mict共分尚的三个分子标记对黄瓜表皮毛发育 基因的最终克隆及黄瓜分子标记辅助育种体系的建立更有帮助；本发明的分子标记可以简 便、快速、高通量的应用于黄瓜育种实践。
[0017] 具体实施方法
[0018]F2代分离群体的构建
[0019] 利用黄瓜无毛突变体（mict)和有毛（Mict)野生型（S77)配制杂交组合，Fi代自 交产生F2代群体，共7936株个体，并鉴定叶片有毛和无毛表型，其中有毛个体5904株，无 毛个体2032株，卡方分析法验证分离比例。因当植株第一片真叶展开时期就可进行表型判 断，分离群体种植在穴盘即可。
[0020] 黄瓜基因组DNA提取
[0021] 用CTAB法提取亲本及F2代分离群体叶片的基因组DNA。取刚刚展开的一片真叶至 1. 5mL离心管中并加入液氮，研磨组织成粉末状，加入500yLCTAB裂解缓冲液，剧烈振荡 30秒，60°C水浴30分钟，期间上下颠倒充分混匀。向上述匀浆裂解液中加入500yL氯仿异 戊醇（24:1，v/v)，上下颠倒充分混勾，13200rpm4°C离心15分钟。吸取上清液500yL至新 的离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒充分混匀，于一 20°C静置30分钟，13200rpm4°C 离心15分钟。弃上清，沿离心管壁加入lmL75%乙醇，上下颠倒洗涤离心管管壁，13200rpm 4°C离心5分钟后弃去乙醇。室温干燥沉淀30分钟，加入100yLRNA酶TE缓冲液（7:993， v/v)溶解，37°C水浴30分钟，核酸仪测定DNA浓度后用TE缓冲液稀释终浓度为30ng/yL， 于一 20°C备用。
[0022] 标记扫描匕分离群体
[0023] 利用本发明开发的三种分子标记扫描上述卩2分尚群体。PCR体系：1XTaqBuffer， 1.5mMMgCl2, 200yMdNTPs，引物各0.2yM，30ng模板DNA，0.5UTaqDNAPolymerase，总反 应体系为 10UI-PCR程序：94°C5 分钟；35 个循环，94°C30 秒，55°C30 秒，72°C30 秒；72°C5 分钟。在PCR产物中加入BioTekeSYBRGreenI核酸染料3yL，4°C静置15分钟使染料与 DNA结合，用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外灯下切下目的片段，使用TaKaRaMiniBEST AgaroseGelDNAExtractionKit回收纯化DNA片段，具体步骤参照试剂盒说明书，产品编 号9762。将纯化片段送由上海桑尼生物科技有限公司测序，测序结果通过Chromas2. 3软 件分析。
[0024] 以上3个分子标记经过&分离群体验证，均与Mict基因位点共分离，且特异性PCR 具有高稳定特征。利用这些分子标记构建高密度遗传和物理图谱，将有助于黄瓜表皮毛发 育基因的最终克隆。
[0025]
【主权项】
1. 一种与黄瓜表皮毛发育基因Mict共分尚的分子标记，命名为 Cosegregated-SNP-01，由序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸片段和SEQ ID NO. 2所示的 核苷酸片段组成，其中SEQ ID NO. 1所示片段与表皮毛发育基因Mict共分离，SEQ ID NO. 2 所示片段与无毛基因mict共分离。
2. 如权利要求1所述与黄瓜表皮毛发育基因Mict共分离的分子标记，其特征在于，所 述分子标记Cosegregated-SNP-01由SEQ ID NO. 7所示上游引物和SEQ ID NO. 8所示的下 游引物扩增得到。
3. 一种与黄瓜表皮毛发育基因Mict共分尚的分子标记，命名为 Cosegregated-SNP-02,由SEQ ID NO. 3所示的核苷酸片段和SEQ ID NO. 4所示的核苷酸片 段组成，其中SEQ ID NO. 3所示片段与表皮毛发育基因Mict共分离，SEQ ID NO. 4所示片 段与无毛基因mict共分离。
4. 如权利要求3所述与黄瓜表皮毛发育基因Mict共分离的分子标记，其特征在于，所 述分子标记Cosegregated-SNP-02由SEQ ID NO. 9所示上游引物和SEQ ID NO. 10所示的 下游引物扩增得到。
5. -种与黄瓜表皮毛发育基因Mict共分离的分子标记，命名为 Cosegregated-SNP-03,由SEQ ID NO. 5所示的核苷酸片段和SEQ ID NO. 6所示的核苷酸片 段组成，其中SEQ ID NO. 5所示片段与表皮毛发育基因Mict共分离，SEQ ID NO. 6所示片 段与无毛基因mict共分离。
6. 如权利要求5所述与黄瓜表皮毛发育基因Mict共分离的分子标记，其特征在于，所 述分子标记Cosegregated-SNP-03由SEQ ID NO. 11所示上游引物和SEQ ID NO. 12所示的 下游引物扩增得到。
【专利摘要】本发明提供了三种与黄瓜表皮毛发育基因Mict共分离的分子标记，第一种命名为Cosegregated-SNP-01，第二种命名为Cosegregated-SNP-02，第三种命名为Cosegregated-SNP-03。本发明中与黄瓜表皮毛发育基因Mict共分离的三个分子标记对黄瓜表皮毛发育基因的最终克隆及黄瓜分子标记辅助育种体系的建立更有帮助；本发明的分子标记可以简便、快速、高通量的应用于黄瓜育种实践。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104593518
【申请号】CN201510088116
【发明人】赵俊龙, 蔡润, 潘俊松, 何欢乐, 王云莉, 朱文莹, 彭佳林, 陈龙
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年2月26日