一株具有催化合成氧化槐定碱的菌株的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物技术领域，具体是涉及具有催化合成抗肿瘤活性的化合物氧化槐定喊(Oxysophoridine, CAS N0.54809-74-4)作用的微生物菌株。
【背景技术】
[0002]槐定碱Sophoridine (SR)是含苦参型的生物碱，为豆科植物苦豆子{Sophoraalope caroides L.)中存在的含量较高生物碱之一。根据学者对其研究发现，槐定碱可存在于中枢神经系统、心血管、免疫系统，且具有抗肿瘤抗微生物和抗内毒素等作用。槐定碱(及其制剂盐酸槐定碱注射液(Sophoridine Hydroehloride Inject1n)已于2005年8月22日获国家食品药品监督管理局(SFDA)颁发的新药证书(国药证字H20051131,30)及药品批准文号(国药准字H20051682，81)，是我国研制、拥有自主知识产权国家一类抗癌新药。初步计算机辅助设计及构效关系研究显示SR经氧化后生物活性发生变化，同时其毒性明显减弱。刘平等研究氧化槐定碱(Oxysophoridine)对、肺癌、肠癌的作用时，氧化槐定碱的冻干粉针、软胶丸、滴丸、薄膜包片及控释胶囊等多种剂型的抗癌活性强于槐定碱，而毒副反应少于槐定碱。
[0003]氧化槐定碱传统的制备工艺是从苦豆子提取分离，但其收率很低，仅为0.015%左右，过度采挖可能导致该物种濒临灭绝，这样会造成植被和人类生存环境，以及生物多样性不可弥补的损失。此外，该提取工艺繁杂、成本高，难以实现大规模工业化生产。国外化学合成方法使用了间氯过氧苯甲酸和二氯甲烷，工艺成本较高，反应立体选择性差，不利于工业生产。而且二氯甲烷属于二类溶剂，应该限制使用。另有报道，SR与双氧水反应的路线来制备氧化槐定碱，但是合成的氧化产物有两种构型。所以函待需求一种高效、经济制备氧化槐定碱的新方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一株具有催化合成氧化槐定碱的植物内生真菌菌株，菌种名称Xylariales.sp,保藏单位:中国典型培养物保藏中心，地址:武汉大学，保藏日:2014年12月24日，保藏登记号:CCTCC M 2014660。该菌能够催化槐定碱生成其氮氧化物氧化槐定碱。
[0005]本发明使用的PDA培养基:去皮马铃薯切块200 g，煮沸约20 min, 8层纱布过滤得滤液，加入葡萄糖20 g，用自来水补足I L，如果配固体培养基I L加入20 g琼脂，pH:自然pH值，放入高压灭菌锅中121°C灭菌20 min。
[0006]本发明的菌种从重庆药用植物蛇足石杉中分离纯化得到，菌种名称Xylariales.5/7，保藏单位:中国典型培养物保藏中心，地址:武汉大学，保藏日:2014年12月24日，保藏登记号=CCTCC M 2014660。
[0007]与现有技术相比，本发明的菌株通过氧化前体底物槐定碱催化制备得到其氮氧化物，只需一步即可制备目标化合物氧化槐定碱，优点在于，(I)成本低:选用自然界廉价易得的天然产物槐定碱为原料，一步反应即可催化合成氧化槐定碱，此外，克服了从植物中提取、分离、纯化过程中使用大量的有机溶剂；(2)选择性高:选择微生物酶为催化剂，具有强的区域选择性和立体选择性；(3)环境友好:因为反应过程温和，无高温高压等苛刻条件，也不需要金属试剂，所以符合当今绿色化学的生产需求；(4)步骤简单:从槐定碱到氧化槐定碱用化学方法需要几步反应，而微生物催化只需一步。综述所述，该方法采用的原料及催化剂便宜、易得，反应条件温和、易控，环境友好，能很好地满足绿色化学和可持续发展化学的发展，及其对现代环境保护和低碳经济的需求。
[0008]本发明采用显微结构以及ITS rDNA序列对目标菌株进行种属鉴定分析。
【附图说明】
[0009]图1为本发明菌株的电子显微镜照片；
图2为本发明菌株催化生成氧化槐定碱的情况；
图3为本发明菌株的系统发育分析；
图4为氧化槐定碱的分离流程；
图5为本发明中目标化合物的13C-NMR ；
图6为本发明中目标化合物的1H-NMIL
具体实施方案
[0010]以下实施方案便于更好地理解本发明。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到。
[0011]本发明的菌种从重庆药用植物蛇足石杉中分离纯化得到，菌种名称:Xylariales.5/7，保藏单位:中国典型培养物保藏中心，地址:武汉大学，保藏日:2014年12月24日，保藏登记号=CCTCC M 2014660。
[0012]1、活性菌株的筛选。
[0013]培养基制作:去皮马铃薯切块200 g，煮沸约20 min，8层纱布过滤得滤液，加入葡萄糖20 g，用自来水补足I L，自然pH值，放入高压灭菌锅中121 °C灭菌20 min。100 mL三角瓶装培养基40 mL, 121°C高温蒸汽灭菌25min，固体培养基每升培养基加20g琼脂。
[0014]将保存的菌种斜面接种到装有PDA培养基的100 mL三角瓶(内装40 mL培养基)中28°C, 140rpm的条件下震荡培养2_3天,加入底物槐定碱约0.5 mg/mL (乙醇溶解)，同样条件下共培养5-7天，用等体积乙酸乙酯萃取一次，减压浓缩后经薄层色谱(TLC)检测转化结果。
[0015]TLC条件:展开剂:氯仿-甲醇=5:1，显色剂:改良碘化铋钾。
[0016]对于阳性反应重复反应过程，以确定转化反应的稳定性。
[0017]2、活性菌株的种属鉴定分析。
[0018]本发明一方面通过显微结构对活性菌株进行种属鉴定分析，在电镜下观察。
[0019]如图1，为阳性菌株的显微结果(10*60)。
[0020]本发明一方面通过采用分子生物学技术通过ITS rDNA序列对活性菌株进行种属鉴定分析。用CTAB法提取核糖体DNA( rDNA)，选择通用引物ITSl和ITS4对ITS区进行PCR扩增，程序如下:94 °C预变性3 min ；94 °C变性30 s ；55 °C复性30 s ；72 V延伸I min, 30个循环后,72 °C后延伸10 min,序列经拼接整理后与GenBank数据比对,确定菌株的种属。从GenBank数据库中获得相似性较高的典型菌株的ITS rRNA序列作为参比对象，采用MEGA 5.0软件进行聚类分析和构建NJ系统发育树。
[0021]如图3，为本发明菌株的系统发育分析。
[0022]3、活性菌株催化合成抗癌化合物氧化槐定碱的应用。
[0023]前体底物槐定碱南京元宝峰医药科技有限公司。微生物催化剂Xylariales.577CCTCC M 2014660。该菌种是从采自重庆的药用植物蛇足石杉中分离纯化得到，现保存于中国典型培养物保藏中心。
[0024]菌株办5/tCCTCC M 2014660催化合成氧化槐定碱的培养采用两步发酵法，先将种子培养液(250 mL培养基/500mL三角瓶)于28°C、140 rpm恒温振荡培养2_3天，以5%的接种量接入放大培养基1000/2000 mL,同样条件下培养3_4天，加入底物I g(ethanol溶解)，7天后用乙酸乙酯萃取培养液，减压蒸干得到粗提物9.1 g。
[0025]转化产物的分离采用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、制备薄层色谱等方法进行分离、纯化，分离流程见图4。通过理化性质和现代波谱学手段(1H-NMRj3C-NM))鉴定了转化产物的结构。
[0026]如图2为本发明菌种催化生成氧化槐定碱的情况(H:槐定碱，YH:氧化槐定碱)。
[0027]如图5为本发明中目标化合物的13C-NMR谱。
[0028]如图6为本发明中目标化合物的1H-NMR谱。
[0029]与目前已公开的技术相比，本发明的新型制备方法是通过氧化前体底物槐定碱得到其氮氧化物的形式，只需一步即可制备目标化合物氧化槐定碱，优点在于:(1)成本低:选用自然界廉价易得的天然产物槐定碱为原料，一步反应即可催化合成氧化槐定碱，此外，克服了从植物中提取、分离、纯化过程中使用大量的有机溶剂(2)选择性高:选择微生物酶为催化剂，具有强的区域选择性和立体选择性；(3)环境友好:因为反应过程温和，无高温高压等苛刻条件，也需要金属试剂的催化，所以符合当今绿色化学的生产需求；(4)步骤简单:从槐定碱到氧化槐定碱用化学方法需要几步反应，而微生物催化只需一步。综述所述，该方法采用的原料及催化剂便宜、易得，反应条件温和、易控，环境友好，能很好地满足绿色化学和可持续发展化学的发展，及其对现代环境保护和低碳经济的需求。
[0030]以上实施例仅仅是进一步阐明本发明，并无将本发明局限于该具体实施例的意图。本领域技术人员应该认识到，本发明涵盖了权利要求书范围内的所有可能的备选方案、改进方案和等效方案。
【主权项】
1.一株具有催化合成氧化槐定碱的菌株,菌种名称Xylariales.sp,保藏单位:中国典型培养物保藏中心，地址:武汉大学，保藏日:2014年12月24日，保藏登记号:CCTCC M2014660。
【专利摘要】一株具有催化合成氧化槐定碱的菌株，菌种名称Xylariales.sp，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：武汉大学，保藏日：2014年12月24日，保藏登记号：CCTCC M2014660。该菌株催化化合物槐定碱只需一步得到其氮氧化物氧化槐定碱，具有成本低、选择性高、环境友好、步骤简单的优点。CCTCC M201466020141224
【IPC分类】C12R1-645, C12N1-14
【公开号】CN104611238
【申请号】CN201510057553
【发明人】付少彬, 孟庆峰, 冉旭, 闫松, 张芸
【申请人】遵义医学院
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年2月4日