一株防治棕榈害虫椰子织蛾的苏云金芽孢杆菌及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属微生物领域，涉及一种苏云金芽孢杆菌菌株及其应用，具体的说，涉及一 株用于防治棕榈害虫椰子织蛾的苏云金芽孢杆菌及应用。
【背景技术】
[0002] 椰子织蛾（Opisina arenosella Walker)属于鱗翅目（Lepidoptera)织蛾科 (Qecophoridae)，英文名为 coconut blackheaded caterpillar，又称椰子木蛾、黑头履带 虫、椰柱蛾、食叶履带虫等，主要分布于斯里兰卡、印度孟加拉、缅甸、印度尼西亚、巴基斯 坦、泰国、马来西亚等地。椰子织蛾幼虫取食棕榈科植物的叶片，严重时整个树冠被入侵啃 食从而导致植株发育缓慢，果实产量大幅减少。对椰子织蛾进行有害生物风险分析结果显 示，其属于高风险有害生物，在我国很多地区易定殖，对我国的椰子、槟榔、蒲葵、中东海枣、 大王棕等棕榈作物威胁很大，在我国具有严重的生态危害性与经济危害性。
[0003] 苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种目前世界上应用最 为广泛的微生物杀虫剂，由于其高效、低毒、安全、经济，因此是最具发展潜力的微生物杀 虫剂，现在已经发现苏云金芽孢杆菌大多数菌株都能产生多种类型的晶体蛋白，对鳞翅目 (Lepidoptera)、双翅目（Diptera)、銷翅目（Coleoptera)、膜翅目（Hymenoptera)、同翅目 (Homoptera)、直翅目（Orthoptera)、食毛目（Mallophaga)等多种昆虫，以及线虫、螨类和 原生动物等具有特异性的杀虫活性，Bt的杀虫范围已经扩大到包括大量农林及卫生害虫在 内的无脊椎的4个门和节肢动物门中9个目的生物。苏云金芽孢杆菌作为生防菌中最重要 的一种，它在使用上有着靶标性强、对人类和牲畜不会造成毒害，以及环境友好型的特点。 经检索，目前尚未见到利用苏云金芽孢杆菌防控椰子织蛾的相关研究与报道。
【背景技术】
[0004]
[0005] 本发明的目的是提供一株防治棕榈害虫椰子织蛾的苏云金芽孢杆菌及应用。
[0006] -株苏云金芽孢杆菌株，命名为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis) BAT-10,已于2014年12月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉 大学；保藏编号：CCTCCN0 :M 2014679。
[0007] 本发明所提供的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)BAT-IO菌株，从海 南省保亭黎族苗族自治县什厚黎村土壤样品中直接分离筛选，经形态学、培养性状、常规生 理生化和16s_rDNA序列鉴定，该菌株为苏云金芽孢杆菌，携带有crylAa、crylGb、crylMa、 crylIa、cry2Af五种杀虫蛋白编码基因。
[0008] 本发明所提供的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)BAT-IO的基本生物 学特性为：
[0009] 将Bt菌株BAT-IO在1/2LB培养基上培养48小时后形成单菌落，菌落乳白色，圆形 或近圆形，边缘整齐，菌落中间较厚，向四周逐渐变薄，一般30小时左右可观察到晶体。扫 描电镜下观察到Bt菌株BAT-IO菌体为长杆状大小为（I. 1-1. 9) ii mX (3. 1-5. 2) ii m，晶体 为菱形，芽孢为椭圆形，近中生，芽孢囊微膨大。
[0010] 本发明所提供的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)BAT-10的用途是其 在防治椰子织蛾中的应用。
[0011] 以本发明所提供的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)BAT-10为活性成 分的生物制剂也属本发明的保护范围。需要的时候，该制剂可以包含生物制剂制备的常用 载体和辅料。
[0012] 本发明通过直接涂抹给药的方法研究苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)BAT-10对椰子织蛾的杀虫活性，实验结果表明苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis) BAT-10的杀虫毒力强、杀虫效果好，对椰子织蛾有很好的杀虫作用。表明该 菌株是一株在防治椰子织蛾上具有潜在意义的生防菌株。
[0013] 本发明通过对土壤中微生物的筛选分离，获得苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)BAT-10,经过杀虫试验表明该菌株对椰子织蛾有很好的杀虫作用，可以有 效地控制椰子织蛾种群数量，减少损失，是一株在防治椰子织蛾上具有潜在意义的生防菌 株，具有杀虫毒力强、杀虫效果好等特点，为我国棕榈科产业的发展提供帮助。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合实施例，对本发明的【具体实施方式】作进一步详细描述。以下实施例用于 说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通 常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0015] 实施例1菌株的筛选及其鉴定
[0016] 1、菌株的筛选
[0017] 从采集自海南省保亭县新政镇什厚黎村的土壤样品中取适量土样加入分离培养 基中，30°C，230rpm摇床培养IOh后，80°C水浴15min，按四个浓度（原液稀释10倍，100倍， 1000倍，10000倍）各吸100 ii L涂固体1/2LB平板（每个浓度涂两个平板），倒入小玻璃 珠左右摇晃，使菌液均匀涂布，室温放置IOmin后将平板置于30°C培养箱，48h后观察菌落 形态，挑选类似Bt的菌落涂片，用复红染色后于油镜下检测是否存在芽孢和伴孢晶体。同 一分离物检出的Bt菌株依其菌落形态和颜色、营养体及孢晶形态等进行取舍，每种形态取 一株进行单菌落纯化后保藏备用。经过纯化后获得中生产性状好、对鳞翅目害虫椰子织蛾 具有高毒力的菌株，命名为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)BAT_10,已于2014 年12月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学；保藏编号： CCTCCNO :M 2014679。
[0018] 2、菌株的形态鉴定
[0019] 将分离纯化得到的菌株BAT-10在1/2LB培养基上培养48小时后形成单菌落，菌 落乳白色，圆形或近圆形，边缘整齐，菌落中间较厚，向四周逐渐变薄。扫描电镜下观察到Bt 菌株菌体为长杆状，芽孢为长圆棒状，晶体为菱形。
[0020] 3、菌株的16S rDNA序列扩增、序列测定及分子分类
[0021] 采用碱裂解法提取菌株BAT-10的DNA，将菌株接种于5mL液体LB培养基试管中 30°C，230rpm活化。按1%接菌量接菌于三角瓶中37°C，230rpm震荡培养4h左右（OD 6tltl =2. 0) 5, OOOrpm，5min 离心收集菌体。每 10OmT,菌液加 2mT, SI [0. 3M Sucrose, 25 u M Tris HCl (pH8. 0)，25 mM EDTA (灭菌），Lysozyme20mg/mL (用时现配）]，混匀，37 °C 放置 2-4h。加 入 2mL 的 SII[2mM EDTA，0. 16 M Na0H，2%SDS，20mM Tris HCl(pH8.0)(现配现用）];加 2mL SIII[3M NaAc，用冰乙酸调至pH5. 2]，轻轻混匀，(TC放置4h以上。12,000印111离心5111111， 取上清，加入等体积异丙醇，-20°C放置30min以上。12, OOOrpm离心5min，弃上清，沉淀用 70%乙醇漂洗。将沉淀在真空干燥器中干燥后用ImL超纯水溶解。加入IOiU RNase，37°C 作用lh，除去RNA。酚、氯仿抽提后，补水至10mL，加入1/10体积的3M NaAC和2倍体积无 水乙醇，-20°C沉淀；12, OOOrpm离心5min，弃上清，沉淀用70%乙醇漂洗，将沉淀（DNA)在 真空干燥器中干燥后用ImL超纯水溶解。电泳检测后-20°C保存待用。
[0022] 采用细菌通用引物 F(5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）与 R(5' -AAGGAGGTGATCCAGCC-3'）PCR扩增BAT-10菌株的16S rDNA序列，引物由上海生工广 州测序部合成，PCR仪：Takara公司。PCR反应体系（50iU) :50ngDNA模板liil，10XPCR buffer 5 ii 1，lOpmol/L 引物各 I ii 1，10mmol/L dNTPsl ii 1，4U/ii 1 的 TaqDNA 聚合酶 I ii 1， 加ddH20补足至50 ill ;PCR反应条件为94°C预变性5分钟后，94°C变性I分钟，52°C退火I 分钟，72°C延伸1分钟，30个循环，最后72°C延伸10分钟，得到该菌株的16S rDNA的保守 序列，通过 NCBI Blast 序列比对和用 DNAMAN5. 2 软件 Multiple Sequence Alignment 分析 并构建系统进化树，鉴定为一株苏云金芽孢杆菌菌株。
[0023] 4、cry基因的扩增、序列测定及分子分类
[0024] BAT-10的DNA的提取方法同3, cry基因鉴定引物见表1，其中cryl类鉴定引物 为 K5un2/K3un2 与 K5un3/K3un3, cryll 类鉴定引物为 S5uni/S3uni，cry2 类鉴定引物为 S5un2/S3un2,其它基因类型的鉴定引物以此类推。分别进行各类cry基因鉴定引物的PCR 鉴定，PCR反应体同3, PCR扩增产物经凝胶回收试剂盒（(Takara公司）纯化后连接T载 体（Takara公司）进行克隆，挑取阳性单克隆送样上海生工进行测序，序列经NCBI BLAST 比对后与 GenBank 已知序列 Sequence ID:gb|AF510713. 1、gb|U70725. 1、emb|Y09326. 1、 §13|肝980886.1、813^?439818.1 的最大相似性分别为98%、99%、99%、92%、99%，确定该 菌株含有crylAa、crylGb、crylMa、crylla、cry2Af五种新型杀虫编码基因。
[0025] 表1鉴定引物序列
[0026]
【主权项】
1. 一株苏云金芽孢杆菌菌株，命名为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis) BAT-10,已于2014年12月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO :M 2014679。
2. 权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)BAT-10在防治椰子 织蛾中的应用。
3. -种防治椰子织蛾的生物制剂，其活性成分为权利要求1所述的保藏编号为 CCTCCNO :M 2014679 的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)BAT-10。
【专利摘要】本发明属微生物领域，涉及一株防治棕榈害虫椰子织蛾的苏云金芽孢杆菌及应用，该菌株命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)BAT-10，已于2014年12月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO：M2014679。本发明所提供的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)BAT-10菌株的用途是其在防治椰子织蛾中的应用，经过杀虫试验表明该菌株对椰子织蛾有很好的杀虫作用，可以有效地控制椰子织蛾种群数量，减少损失，是一株在防治椰子织蛾上具有潜在意义的生防菌株，具有杀虫毒力强、杀虫效果好等特点，为我国棕榈科产业的发展提供帮助。CCTCCNO：M 201467920141231
【IPC分类】C12N1-20, A01P7-04, A01N63-00, C12R1-645
【公开号】CN104611277
【申请号】CN201510079220
【发明人】孙晓东, 覃伟权, 阎伟, 李朝绪, 吕朝军, 牛小庆, 余凤玉
【申请人】中国热带农业科学院椰子研究所
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年2月15日