南美白对虾对虾杆状病毒检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及引起南美白对虾(凡纳滨对虾）形成金字塔包涵体对虾杆状病毒特异 性PCR快速检测试剂盒及检测方法，特别涉及一种南美白对虾对虾杆状病毒的基因检测试 剂及检测方法，适用于南美白对虾对虾杆状病毒病流行病学监测、对虾杆状病毒的检测及 基因工程技术等领域。
【背景技术】
[0002] 对ife下杆状病毒（Baculovirus penaei，BP)，属杆状病毒科（Baculoviridae)。该 病毒主要引起滨对虾属（如南美白对虾)、明对虾属（如中国对虾)、美对虾属、沟对虾属等在 内的所有对虾品种感染发病，以幼体、仔虾和早期幼虾对病毒最敏感，可引起对虾幼体几乎 100%死亡。对奸杆状病毒最早于墨西哥湾北部水域的桃红对奸（Penaeus duorarum)的肝 胰腺中发现（Couchl974)，主要分布在中美洲和南美洲沿太平洋地区，如厄瓜多尔、哥斯达 黎加、巴拿马、美国的佛罗里达、密西西比、德克萨斯和夏威夷群岛等。对虾杆状病毒主要危 害对虾的肝胰腺、中肠上皮细胞，并只在细胞核内复制，产生多个金字塔状的核内包涵体， 少量包涵体在粪便中游离存在。对虾杆状病毒病毒粒子大小为74nm?270nm，为有囊膜的 环状超螺旋双链DNA病毒，目前未见完整对虾杆状病毒基因序列分析的报道。近年，南美白 对虾的养殖在我国得到了很大的发展，但随着养殖面积的扩大和养殖环境的恶化，其病害 也越来越严重，对虾杆状病毒病现在只在个别池塘发生，整体危害还不大，但如果不提前防 范任其发展，将对南美白对虾的生产带来不可估量的损失。我国2008年在农业部公告第 1125号将其列为二类动物疫病。
[0003] 经对现有技术的文献检索发现，尚未发明与本发明的南美白对虾对虾杆状病毒特 异性PCR快速检测试剂盒及检测方法、引物对有关的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种南美白对虾对虾 杆状病毒特异性PCR检测方法，能快速、高效地用于对虾杆状病毒的检测。
[0005] 1.南美白对虾对虾杆状病毒的PCR快速检测试剂盒，所述试剂盒包括：
[0006] (I) 2X反应混合缓冲液I. OmL，包含以下成分：
[0007] KCl 20οιΜ?
[0008] \1gCh 25 m VI, Tris-HCL pH5.8 40mM, (.!MP
[0009] (2)检测引物的设计合成：根据GenBank中发布的对虾杆状病毒的基因序列，设 计一对特异性检测引物，上游引物BP-F :5' -GATCTGCAAGAGGACAAACCT-3'，下游引物BP-R : 5' -TGTTTGCTGATGTATTGGCCG-3'，浓度为 10 μ M ;
[0010] (3) Taq 酶 5U/μ L ;
[0011] (4)灭菌的 ddH20 LOmL;
[0012] (5)阳性对照液：对虾杆状病毒基因组DNA ;
[0013] (6)阴性对照液：健康南美白对虾组织总DNA。
[0014] 2.根据权利要求1所述的试剂盒，采用试剂盒检测南美白对虾对虾杆状病毒的方 法为：
[0015] (1)对虾杆状病毒DNA的提取：取50-100mg的鳃和肌肉组织，加入600μ L灭菌处 理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于_20°C冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心10 分钟，取上清，加入200 μ L Tris-饱和酚，充分振荡混匀后，静置5分钟，然后12000rpm离 心5分钟，取上清液加入等量的酚：氯仿：异戊醇抽提二次，取上清加入2倍体积的异丙醇， 混匀后，静置10分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清后，加入ImL预冷的75%的乙醇，静 置5分钟，12000rpm离心10分钟,去掉上清,置于真空干燥箱干燥后,用50μ L的ddH20溶 解，即为试验用DNA模板，提取的DNA模板置于-70°C保存备用；
[0016] (2) PCR反应体系：采用25μ L的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加 入2X反应混合缓冲液12. 5yL，上游引物、下游引物各0. 5yL，5U/yL Taq DNA聚合酶 0. 5 μ L，DNA模板3. 0 μ L，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液 作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上；
[0017] (4)PCR反应条件：94°C预变性5分钟；然后94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C 延伸30秒，共循环35次；72°C延伸10分钟，最后4°C保存；
[0018] (5)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μ L产物在1. 5%琼脂糖凝胶(含溴 化乙锭0. 5 μ g/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR 产物的预期大小；
[0019] (6)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在380bp处 出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为对虾杆状病毒阳性；若阳性对照可见目的 条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的对虾杆状病毒。
[0020] 与现有技术相比，本发明所述的南美白对虾的病原对虾杆状病毒的特异性PCR快 速检测试剂盒及其检测方法具有以下特点及优点：
[0021] (1)通过最近几年南美白对虾的流行病学调查发现，目前南美白对虾的病害越来 越严重，危害越来越大，除常见的白斑综合症病毒（WSSV)、桃拉病毒（TSV)、传染性皮下及 造血器官坏死病毒（IHHNV)外，就连被我国列为二类传染性水生动物疾病的对虾杆状病毒 (BP)病也逐渐增多。而本发明根据这个病毒的核苷酸序列设计出一对特异性引物，采用聚 合酶链式反应（PCR)技术，对患对虾杆状病毒病和隐性感染的南美白对虾进行定性检测，经 检测并测序验证，可用于对虾杆状病毒病的快速、高效地检测。
[0022] (2)本发明提供了针对上述PCR优化的PCR反应液、反应体系和反应条件。反应时 将反应液、酶、引物、模板和适量的水混合，整个反应所需要的时间在1.5个小时内即可完 成。
【附图说明】
[0023] 图1为感染对虾杆状病毒南美白对虾组织的PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号 1为阴性对照（以阴性对照液作为模板）;标号2为阳性对照（以阳性对照液作为模板）;标号 3为对虾杆状病毒感染南美白对虾组织样品；标号M为分子量标准DL2000 (购自宝生物工 程有限公司）;纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的 数量。
[0024] 图2为对不同病原的PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为对虾杆状病毒；标 号2为白斑综合症病毒；标号3为传染性皮下及造血器官坏死病毒；标号4为桃拉病毒；标 号5为黄头病毒；标号6为肝胰腺细小病毒；标号7为传染性肌肉坏死病毒；标号8为副 溶血弧菌；标号9为溶藻弧菌，标号M为分子量标准DL2000 ;纵坐标中：bp为碱基对，2000、 1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。
[0025] 图3为8尾南美白对虾组织样品的PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为阴性 对照（以阴性对照液作为模板）；标号2为阳性对照（以阳性对照液作为模板）；标号3-10为 8尾不同南美白对虾组织样品；标号M为分子量标准DL2000 ;纵坐标中：bp为碱基对，2000、 1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。
[0026] 图4为5份南美白对虾组织样品的PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为阴 性对照（以阴性对照液作为模板);标号2为阳性对照（以阳性对照液作为模板);标号3-7为 5份不同地区南美白对虾组织样品；标号M为分子量标准DL2000 ;纵坐标中：bp为碱基对， 2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明：
[0028] 实施例一：南美白对虾对虾杆状病毒PCR快速检测试剂盒
[0029] 本实施例所述的南美白对虾对虾杆状病毒PCR快速检测试剂盒的所有化学试剂 及引物均从专业的试剂公司购买。但上述试剂和引物来源不构成对本发明的任何限制，本 发明可自行配制有关试剂和合成有关引物。
[0030] 试剂盒由下列部分构成（9样份）：
[0031] (I) 2X反应混合缓冲液（Reaction Mix Buffer) I. OmL，包含以下成分：
[0032] KCl 20mM, MgCI2 25mM, Tris-HCl, pH5.8 40mM, dNTP 2,5mM =
[0033] (2 )检测引物：上游引物 BP-F : 5 ' -GATCTGCAAGAGGACAAACCT-3 '，下游引物 BP-R : 5' -TGTTTGCTGATGTATTGGCCG-3'，浓度为 10 μ M，上下游引物混合，400 μ L。
[0034] (3) Taq 酶 5U/yL。
[0035] (4)灭菌的 ddH20 l.OmL。
[0036] (5)阳性对照液：对虾杆状病毒基因组DNA。
[0037] (6)阴性对照液：健康南美白对虾组织总DNA。
[0038] (7)操作说明书一份。
[0039] (8)长方体盒子，可装上述1?7号部件，9. 0X5. 0X5. 0cm3。
[0040] (9)一块硬纸板，其大小与盒子的底面相同，搞2. 5cm，有2排孔，每排4个孔，孔径 I. 0cm，上述各小管分别对应放置于这些小孔中，装于长方体盒子中。
[0041] 上述阳性对照和阴性对照是分别取IOOmg对虾杆状病毒感染的虾和正常的虾的 鳃丝和肌肉组织，加入600 μ L灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于-20冰°〇 箱反复冻融3次，6000rpm低温离心10分钟，取上清，加入200 μ L Tris-饱和酚，充分振荡 混匀后，静置5分钟，然后12000rpm离心5分钟，取上清液加入等量的酚：氯仿：异戊醇抽提 二次，取上清加入2倍体积的异丙醇，混匀后，静置10分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上 清后，加入ImL预冷的75%的乙醇，静置5分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清，置于真空 干燥箱干燥后，用100 μ L的ddH20溶解而得。
[0042] PCR扩增反应体系（25 μ L)为：
[0043] 2x反应混合缓冲液 12.5μ[ Taq DNA 聚介H ΙμΙ 丨