一种基于酶固定化的酵母发酵生产低聚乳果糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程技术领域，涉及低聚乳果糖的生产方法。
技术背景
[0002]低聚乳果糖自1990年开发以来，在日本被广泛认可并迅猛发展。2005年调查表明，低聚乳果糖已成为日本第三大功能性低聚糖消费品。近年来许多研宄者发现低聚乳果糖具有许多特定的生理功能，有望成为继低聚果糖、低聚半乳糖后又一种被全球认可的功能性食品添加剂。但是由于大部分微生物的呋喃果糖苷酶产量较低以及合成过程中的一些技术壁皇，目前只有日本盐水港精糖株式会社能够规模化生产。
[0003]低聚乳果糖在国内尚未实现产业化，主要原因是节杆菌发酵产酶水平较低，发酵机制不清楚，β -呋喃果糖苷酶生产成本较高，以及酶促反应合成产率低，低聚乳果糖纯化较为困难等。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是克服现有技术的不足，提出一种基于酶固定化的酵母发酵生产低聚乳果糖的方法，通过提高节杆菌产出的呋喃果糖苷酶的酶活和底物利用率，以及减少产低聚乳果糖过程中的副产物，来提高低聚乳果糖的浓度和纯度。
[0005]本发明是通过以下技术方案实现。
[0006](I)在260-280X 103U/L的酶液中加入甘露醇至甘露醇终浓度为l-2mmol/L ;然后按混合酶液:海藻酸钠溶液体积比为1: 1-2的比例与浓度为2.4-2.8g/L的海藻酸钠溶液混合，再按1:2-3的体积比滴入到浓度为0.5-0.8mol/L的氯化钙溶液中，固定40_50min，过滤后放入质量百分比为7-8%双醛淀粉溶液中交联，在25-30°C下进行交联15-20min，得到固定化酶。
[0007](2)将罗伦隐球酵母置于YPD培养基经200 r/min,30 °C、pH7.0培养24 h，然后3000r/min离心lOmin，并用水洗涤2次，回收得到酵母菌。
[0008](3)将蔗糖和乳糖按1:1的质量比，配成580-680 mmol/L溶液，按1:1.5-2的体积比与步骤(I)中的固定化酶混合，在PH6-7，温度25-30°C条件下反应，反应至Il_12h时加入1-2%质量比的步骤(2)得到的酵母菌，共反应24 h，沸水浴灭酶20 min终止反应。
[0009]本发明步骤(I)所述的酶为β -呋喃果糖苷酶。
[0010]本发明步骤(2)得到的酵母菌缺少分解蔗糖的酶。
[0011]本发明与不加酵母酶法合成低聚乳果糖相比，低聚乳果糖浓度提高到160_165g/L ;乳糖转化率提高了 30-33%，提高原料利用率降低生产成本；低聚乳果糖最终含量提高到了 54-58%，减少了后续产品纯化成本。同时该方法可以推广到酶法合成低聚糖中副产物以葡萄糖(单糖)为主的反应中使用，如低聚半乳糖、低聚果糖等。
【具体实施方式】
[0012]本发明将通过以下实施例作进一步说明。
[0013]本发明实施例涉及以下技术内容。
[0014](I) β-呋喃果糖苷酶酶活。
[0015]β -呋喃果糖苷酶酶液制备:节杆菌发酵结束后，将培养液以转速4000 r/min离心20 min，将上清液至于-20 ° C冷藏；24 h后取出常温解冻，部分未去除的菌体因细胞肿胀而死亡，再以转速4000 r/min转速离心20 min后上清液即为β-呋喃果糖苷酶酶液。
[0016]β -呋喃果糖苷酶酶活定义:将2 mL的β -呋喃果糖苷酶酶液和5mL的糖液(含30%的蔗糖与30%的乳糖，pH 7.0)于37。C反应，一个酶活力单位定义为每分钟产生10_9mol低聚乳果糖的量来表示。
[0017](2)低聚乳果糖的测定。
[0018]低聚乳果糖的测定采用HPLC，HPLC色谱条件:色谱柱！Kromasil氨基柱(250mmX4.6 mmX5 mm);流动相:乙腈-水(75:25);流速:1 mL/min ;漂移管温度:70 ° C ;柱温:30。Co标准曲线的方程:浓度范围为0.1281-4.1 mg/mL，InS = 1.0181nC+6.134 ;相关系数 R2= 0.9997。
[0019](3)残糖的测定。
[0020]采用蒽酮比色法，取测发酵液离心后上清液I mL，加入4 mL新配制的蒽酮试剂(2g/L)，混匀后盖塞冰浴，后沸水浴10 min，冷却后在620nm处测吸光值。标准曲线的方程为:y=0.0091X+0.0124 ;浓度范围为 10-100 mg/L，相关系数 R2= 0.9996。
[0021]实施例1。
[0022]a.在260 U/mL的β -呋喃果糖苷酶中加入甘露醇至甘露醇终浓度为lmmol/L ;然后按混合酶液:海藻酸钠溶液体积比为1:1的比例与浓度为2.5g/L的海藻酸钠溶液混合，再按1:2的体积比滴入到浓度为0.5 mo I/L的氯化钙溶液中，固定40_50min，过滤后放入质量百分比为8%双醛淀粉溶液中交联，在25-30°C下进行交联15-20min，得到固定化酶。
[0023]b.将罗伦隐球酵母置于Yro培养基经200 r/min,30 °C、pH7.0培养24 h，然后3000r/min离心lOmin，并用水洗涤2次，回收得到酵母菌。
[0024]c.600 mmol/L的鹿糖和乳糖与a中的固定酶以1: 1.5的体积比混合，在pH6-7，温度25-30°C条件下反应，在反应到11.5h时加入1.4%质量比的b中得到的酵母菌，反应24 h后经沸水浴灭酶20 min终止反应。
[0025]最终低聚乳果糖含量为158.75 g/L,产率50.67%，乳糖转化率57.52%。加入酵母合成低聚乳果糖最终产物葡萄糖从60.48 g/L下降到1.88 g/L。
[0026]实施例2。
[0027]a.在280 U/mL的β -呋喃果糖苷酶加入甘露醇至甘露醇终浓度为2mmol/L ;然后按混合酶液:海藻酸钠溶液体积比为1:1的比例与浓度为2.8g/L的海藻酸钠溶液混合，再按1:2的体积比滴入到浓度为0.6 mol/L的氯化妈溶液中，固定40_50min，过滤后放入质量百分比为7%双醛淀粉溶液中交联，在25-30°C下进行交联15-20min，得到固定化酶。
[0028]b.将罗伦隐球酵母置于Yro培养基经200 r/min,30 °C、pH7.0培养24 h，然后3000r/min离心lOmin，并用水洗涤2次，回收得到酵母菌。
[0029]c.650 mmol/L的鹿糖和乳糖与a中的固定酶以1: 1.5的体积比混合，在pH6-7，温度25-30°C条件下反应，在反应到11.5h时加入1.6%质量比的b中得到的酵母菌，反应24 h后经沸水浴灭酶20 min终止反应。
[0030]最终低聚乳果糖含量为155.76 g/L，产率50.11%，乳糖转化率55.35%。加入酵母合成低聚乳果糖最终产物葡萄糖从60.48 g/L下降到1.57 g/L。
【主权项】
1.一种基于酶固定化的酵母发酵生产低聚乳果糖的方法，其特征是包括以下步骤: (1)在260-280X103U/L的酶液中加入甘露醇至甘露醇终浓度为l-2mmol/L ;然后按混合酶液:海藻酸钠溶液体积比为1: 1-2的比例与浓度为2.4-2.8g/L的海藻酸钠溶液混合，再按1:2-3的体积比滴入到浓度为0.5-0.8mol/L的氯化钙溶液中，固定40_50min，过滤后放入质量百分比为7-8%双醛淀粉溶液中交联，在25-30°C下进行交联15-20min，得到固定化酶； (2)将罗伦隐球酵母置于Yro培养基经200r/min、30。C、ρΗ7.0培养24 h，然后3000r/min离心lOmin，并用水洗涤2次，回收得到酵母菌体； (3)将蔗糖和乳糖按1:1的质量比，配成580-680 mmol/L溶液，按1: 1.5_2的体积比与步骤(I)中的固定化酶混合，在pH6-7，25-30°C条件下进行反应，在反应至ll_12h时加入1-2%质量比的步骤(2)得到的酵母菌体，共反应24 h，经沸水浴灭酶20 min终止反应； 步骤(I)所述的酶为β-呋喃果糖苷酶。
【专利摘要】一种基于酶固定化的酵母发酵生产低聚乳果糖的方法，包括以下步骤：（1）260-280×103U/L的β-呋喃果糖苷酶液加甘露醇至甘露醇终浓度1-2mmol/L；按1:1-2体积比与2.4-2.8g/L海藻酸钠混合，按1:2-3体积比滴入0.5-0.8mol/L氯化钙，固定40-50min，过滤后放入质量比7-8%的双醛淀粉溶液中交联15-20min，得固定化酶；（2）罗伦隐球酵母于YPD培养基，30℃，200r/min，pH7.0培养24h，离心，水洗回收酵母；（3）蔗糖和乳糖1:1质量比配成580-680mmol/L溶液，按1:1.5-2体积比与（1）中的酶混合，pH6-7，25-30℃反应24h，在11-12h时加入1-2%质量比（2）中的酵母，沸水浴终止反应。本发明低聚乳果糖含量54-58%，浓度160-165g/L，乳糖转化率56-58%，可减少产品纯化成本。
【IPC分类】C12N11-10, C12P19-14, C12R1-645, C12N11-04
【公开号】CN104630306
【申请号】CN201410801899
【发明人】阮征, 米书梅, 印遇龙, 江波, 周艳, 邓泽元
【申请人】南昌大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2014年12月23日