红颈常室茧蜂特异性coi引物、含有其的试剂盒及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学领域，具体地说，设及红颈常室虽蜂特异性C0I引物、含有 其的试剂盒及应用。
【背景技术】
[0002] 绿盲睹Apolygus lucorum(M巧er-Dilr)属于同翅目盲睹科，是我国各棉区的盲睹 优势种，现已上升为棉田主要害虫。对于绿盲睹的防治，长期W来都未有十分有效的措施， 一般是W化学农药防治为主。然而，随着农药的的使用，绿盲睹抗药性不断增强，绿盲睹的 防治难度加大。寄生性天敌作为生物防治的手段之一，依靠寄生因子如毒液、多分DNA病 毒、类病毒颗粒、类病毒纤丝、卵巢蛋白、崎形细胞极其分泌蛋白等方式影响寄主的生殖发 育最终导致其死亡，在害虫控制方面发挥着积极重要的作用。
[0003] 由于寄生蜂种类繁多复杂，且一般个体较小，从形态上较难鉴定区别。若想鉴定寄 主体内未成熟发育阶段的寄生蜂，难度将更大。利用分子检测手段，不论是对寄生蜂个体， 还是对寄生于寄主体内的寄生蜂，均可通过特异性引物扩增完成鉴定，该就大大的减轻了 鉴定工作的强度和难度，节省时间，准确性高。
[0004] 红颈常室虽蜂（Peristenus sprees Qien&van Achterberg)属膜翅目虽蜂科，是 绿盲睹若虫寄生蜂。由于寄生蜂在田间不易观察，且被寄生的绿盲睹易在田间死亡等原因， 一直无法对其与绿盲睹的寄生关系进行更好的研究，鉴定工作也受到制约，无法准确评估 红颈常室虽蜂对绿盲睹的控制作用。本发明即提供了一种高效便捷的分子检测方法，利用 特异性引物扩增有效鉴定红颈常室虽蜂，为准确评估红颈常室虽蜂对绿盲睹生物防治效果 提供有效手段支撑。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供红颈常室虽蜂特异性C0I引物、含有其的试剂盒及应用。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明根据红颈常室虽蜂的线粒体DNA序列，设计筛选得 到一对红颈常室虽蜂特异性C0I引物，其包括：
[0007] 正向引物 PsFl ;5' -TATTAAGAAGAATAATTGGGATG-3'
[0008] 反向引物 PsRl ;5' -ATTTAAATTTCGATCTGTTAATAAC-3,。
[0009] 本发明还提供含有引物PsFl和PsRl的用于检测红颈常室虽蜂的试剂盒。所述试 剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg"、PCR反应缓冲液等中的至少一种。优选地，所述试 剂盒还包括标准阳性模板。
[0010] 本发明还提供所述引物PsFl和PsRl，化及含有引物PsFl和PsRl的试剂盒在检测 红颈常室虽蜂中的应用。
[0011] 本发明还提供一种红颈常室虽蜂的特异性快速PCR检测方法，包括W下步骤： [001引 1)提取样品DNA;
[001引 。W步骤1)提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物PsFl和PsRl进行 PCR扩增反应；
[0014] 扣分析PCR产物。
[00巧]PCR反应体系W 20yL计为；
[0016]
【主权项】
1. 红颈常室茧蜂特异性COI引物，其特征在于，其包括： 正向引物 PsFl :5' -TATTAAGAAGAATAATTGGGATG-3' ； 反向引物 PsRl :5' -AITTAAAITTCGATCTGTTAATAAC-3'。
2. 用于检测红颈常室茧蜂的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的 引物。
3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚 合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的至少一种。
4. 根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
5. 权利要求1所述引物或权利要求2-4任一项所述试剂盒在检测红颈常室茧蜂中的应 用。
6. 红颈常室茧蜂的特异性PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 提取样品DNA ; 2) 以步骤1)提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物PsFl和PsRl进行PCR扩 增反应； 3) 分析PCR产物。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR反应体系以20 μ L计为： 模板 DNA l.OpL 2.5mM dNTPs 0.4μΙ.. ΙΟμΜ 引物 PsFl 0.4μL ΙΟμΜ 引物 PsRl 0.4μΙ.. 5U4iL Easy Γ叫 DNA聚合酶 0.2μL 10. Easy 缓冲液 2.0μΙ^ ddH20 补足至 20μΕ。
8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为：94°C预变性4分钟； 94°C变性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸30秒，共40个循环。
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，具体提供了红颈常室茧蜂特异性COI引物、含有其的试剂盒及应用。本发明根据红颈常室茧蜂mtDNA的保守序列，设计了一对红颈常室茧蜂特异性COI引物PsF1和PsR1(如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示)，经检测，该对引物仅对红颈常室茧蜂具有特异性扩增能力，扩增产物大小为263bp，灵敏度DNA浓度检出限为0.625ng/μL。本发明利用PCR检测技术，由特异性引物扩增得到特异性单一条带，操作简单，具有高效、价廉、特异性强的特点，提高了检测的准确性。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104630367
【申请号】CN201510065234
【发明人】李金花, 杨帆, 罗素萍, 袁海滨, 陆宴辉
【申请人】中国农业科学院植物保护研究所
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月6日