一株猪源枯草芽孢杆菌及其固态发酵制备的饲料益生菌剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株猪源枯草芽孢杆菌以及其固态发酵的应用。涉及粮油副产物的综 合利用、抑制致病菌菌株的筛选和固态发酵工艺优化等研究内容。
【背景技术】
[0002] 当前抗生素在畜禽饲料中添加已成普遍现象，抗生素在畜禽及肉蛋奶制品中的残 留已严重威胁人类健康，寻找安全的抗生素替代品已成学术领域研究热点。枯草芽孢杆菌 作为我国农业部允许添加的饲料用菌种之一，具有很强的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等胞外 酶的分泌能力，能提高动物的消化吸收率及饲料转化率，能分泌抑菌物质又不引发抗生素 残留问题，对于动物防病和促进生长起到重要作用，是安全、绿色、环保的抗生素替代品，已 被研制成越来越多的微生物制剂。
[0003] 稻谷壳、秸杆、豆柏是我国北方地区粮油加工副产品，随着我国粮食产量逐年增 产，这些副产物产量也不断增长。稻谷壳、秸杆因主要含有纤维素、半纤维素成分，适口性 不佳，不能直接饲喂动物，大都被直接废弃或焚烧，既污染环境又浪费资源。豆柏是大豆提 取油脂后的副产品，虽然粗蛋白含量高，氨基酸组成平衡，但目前豆柏大都是经高温加工的 副产品，蛋白质变性严重，溶解性差，存在一些抗营养因子，直接饲喂动物不能获得满意的 效果，导致营养资源的浪费。如何有效利用这些粮油副产物、提高其经济价值已成为当务之 急。
【发明内容】
[0004] 本发明将枯草芽孢杆菌应用于以秸杆、稻谷壳和豆柏为原料的固态发酵制备益生 菌剂，所用菌株能够明显抑制致病菌沙门氏杆菌和单增李斯特菌，所制枯草芽孢杆菌菌剂 预添加于猪饲料中，为进一步替代饲料中抗生素、解决饲料及猪肉中抗生素残留问题，提供 一种绿色饲料添加剂。
[0005] 本发明包括以下步骤： 1、本发明中涉及一种猪源枯草芽孢杆菌，菌株名称YSJB-30,分类命名为枯草芽孢杆菌 及^7^/>5>?//^7/>5，保存编号为061?1：此.9660，保藏日期 ：2014年9月15日，保藏单位： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号 院3号。
[0006] 2、本发明涉及的猪源枯草芽孢杆菌YSJB-30菌株体外抑制肠道致病菌丹增李斯 特菌、沙门氏杆菌呈阳性。
[0007] 3、本发明涉及的猪源枯草芽孢杆菌菌株YSJB-30产胞外蛋白酶。
[0008] 4、利用枯草芽孢杆菌YSJB-30固态发酵制备猪源益生菌剂，以粮油副产物秸杆、 稻谷壳、S?柏为原料，质量比例为結杆：稻谷壳：S?柏=3~5:1:4~6。
[0009] 5、利用枯草芽孢杆菌YSJB-30固态发酵制备猪源益生菌剂，固态发酵工艺为初始 pH 5 ~8,发酵温度 30 ~38 °C，加水量 50 ~80%，K2HP04 0 . 8 ~1.6%，MgS04 0 . 04 ~0.08%， 玉米浆〇? 5~1%，葡萄糖1~2%，（NH4) 2S04 0? 1~0? 2%。
[0010] 6、利用枯草芽孢杆菌YSJB-30固态发酵制备猪源益生菌剂，发酵时间36h，枯草芽 孢杆菌活菌数量达到1 xlO9 CFU / g以上。
[0011] 本发明结合原料成本和产品质量，以活菌数为考察指标，确定符合菌体生长的最 佳原料配比，采用Plackett-Burman设计、最陡爬坡法及响应面分析法优化发酵工艺参数。 本发明为固态发酵制备替代抗生素的饲料益生菌剂提供了基础数据，同时对我国北方地区 粮油副产物的综合利用和资源开发具有重要意义。
【附图说明】
[0012] 图1本发明生产工艺流程图 图2枯草芽孢杆菌YSJB-30体外抑制致病菌抑菌平板 图3 YSBJ-30菌株总DNA琼脂糖凝胶电泳检测图 图4 YSBJ-30菌株16S rRNA基因PCR产物凝胶电泳检测图 图5 YSBJ-30菌株16S rRNA基因序列 图 6 YSBJ-30 菌株 16S rRNA 基因序列与 strain B_A 16S ribosomal RNA gene 比对结果。
【具体实施方式】
[0013]
【具体实施方式】一：YSJB-30菌株的筛选 从健康母猪新鲜粪便中分离筛选得到一株枯草芽孢杆菌YSJB-30的方法如下：取新鲜 母猪粪便放入无菌容器中，密封，冰盒保存，快速送入实验室进行常规菌种分离。分离平板 培养基为添加了脱脂乳的CM培养基。样品无菌条件下，梯度稀释后，将涂布平板于30°C倒 置培养1~2天，分别挑取菌落周围出现透明圈的单菌落于CM斜面培养基，共50支，30°C 培养1~2天，4°C备用。
[0014] 无菌条件下，分别将上述50支斜面各一菌环接入灭菌后的液体CM培养基， 37°C 180rpm摇床培养16h，菌液离心取上清液，进行沙门氏杆菌、单增李斯特菌的抑菌试 验，获得抑菌圈大、抑制上述两种致病菌的菌株6株。再分别将6株斜面各一菌环接入液体 CM培养基，37°C过夜180rpm培养，测定上清液中蛋白酶活力，取最高酶活菌株，即为实验菌 株，命名YSJB-30。
[0015]
【具体实施方式】二：提取菌体基因组DNA及16SrDNA的PCR扩增： 挑取一菌环斜面菌体接入2ml CM液体培养基，37°C培养16h~18h，取1. 5ml活化菌 液，12 000r /min离心1 min，弃上清液，收集菌体，按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明 书上的方法提取细菌基因组DNA，一 20°C保存备用。0.8%的琼脂糖凝胶检测提取的基因组 DNA，凝胶成像系统观察拍照，见说明书附图。
[0016] PCR 扩增 16SrDNA 序列： 引物：799F 5, -AACAGGATTAGATACCCTG-3，，1492R 5, -GGTTACCTTGTTACGACTT-3，。
[0017] 以提取的菌体基因组DNA为模板，进行16SrDNA的PCR扩增。PCR扩增反应体系 25 u L ： 10XPCR buffer 2.5 uL, dNTP (2. 5mM) (TaKaRa) 2 uL,799F (lOpmol/uL) (invitrogen) 0.1 uL，1492R (lOpmol/uL) (invitrogen) 0.1 uL，Taq 聚合酶（5U/uL) (TaKaRa) 0.125 uL，Templet (提取的 DNA) 0.5 uL，ddH20 to 25 uL。
[0018] PCR 扩增程序：94°C 预变性 5min。94°C 变性 lmin，52°C 退火 lmin，72°C 延伸 lmin，30个循环，72°C延伸10min。4°C备用。上述PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，电压 100 V，电泳结束，凝胶成像系统观察拍照，见说明书附图。
[0019] 回收16SrDNA PCR扩增产物，送去测序，测序结果见说明书附图。将测序结果在 NCBI进行Blast比对，结合形态学特征，初步鉴定为枯草芽孢杆菌。
[0020] 【具体实施方式】三：枯草芽孢杆菌YSJB-30菌株抑菌试验： 取灭菌的液态CM培养基10 mL/100mL三角瓶，每瓶接入已活化的枯草芽孢杆菌 YSJB-30斜面菌体一菌环，好氧35~36 °C培养24 h，8000 rpm离心lmin，取上清液，挑取 活化后的单增李斯特菌、沙门氏杆菌菌体各一菌环，分别接入CM液体培养基中37 °C培养 过夜，梯度稀释适当倍数，涂平板，静置20 min后，用打孔器打孔，每孔无菌操作加入上述上 清液100 ul，静置30 min，补加上清液至满孔，37 °C培养过夜，观察并测定抑菌圈直径； 【具体实施方式】四：枯草芽孢杆菌YSJB-30胞外蛋白酶测定： 液态CM培养基10 mL/100mL三角瓶，接入已活化的枯草芽孢杆菌YSJB-30斜面菌体一菌 环，好氧35~36 °C培养24 h，8000 rpm离心lmin，取上清液，测定胞外蛋白酶活力39U/ml。 [0021] 【具体实施方式】五：发酵原料配比的确定： 分别按秸杆：稻谷壳：豆柏比例3:1:6,4:1:5,5:1:4,6:1:3,7:1:2,8:1:1进行固态发 酵培养基的配制，水分添加量为50%，在36°C的条件下培养36 h，取样测定枯草芽孢杆菌活 菌数，结果如下表1 : 表1发酵原料配比
【主权项】
1. 一种猪源枯草芽孢杆菌，其特征在于：菌株名称YSJB-30,分类命名为枯草芽孢杆菌 AaciBw1S 保存编号为CGMCC No. 9660,保藏日期：2014年9月15日，保藏单位： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号 院3号。
2. 根据权利1所述的猪源枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于：所述菌株体外抑制肠道致 病菌丹增李斯特菌、沙门氏杆菌呈阳性。
3. 根据权利1所述的猪源枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于：菌株YSJB-30产胞外蛋白 酶。
4. 利用权利1所述菌株固态发酵制备猪源益生菌剂，其特征在于：以粮油副产物秸杆、 稻谷壳、S·柏为原料，质量比例为結杆：稻谷壳：見柏=3~5:1:4~6。
5. 利用权利1所述菌株固态发酵制备猪源益生菌剂，其特征在于：固态发酵工艺为初 始 pH 5 ~8,发酵温度 30 ~38 °C，加水量 50 ~80%，K2HPO4 0· 8 ~L 6%，MgSO4 0· 04 ~ 0· 08%，玉米浆 0· 5 ~1%，葡萄糖 1 ~2%，（NH4) 2S04 0· 1 ~0· 2%。
6. 利用权利1所述菌株固态发酵制备猪源益生菌剂，其特征在于：发酵时间36h，枯草 芽孢杆菌活菌数量达到I XlO9 CFU / g以上。
7. 权利要求1-6中任意所述的方法得到的枯草芽孢杆菌益生菌剂。
【专利摘要】本发明从健康母猪新鲜粪便中分离筛选到一株枯草芽孢杆菌YSJB-30，结合形态学及16SrDNA 序列比对结果，初步鉴定为是枯草芽孢杆菌。该菌株分泌胞外蛋白酶，体外试验可抑制肠道致病菌沙门氏杆菌和丹增李斯特菌。将该菌应用于以秸秆、稻谷壳和豆粕为原料的固态发酵制备益生菌剂，结合原料成本和活菌数，确定了最佳原料配比；采用Plackett-Burman设计、最陡爬坡法及响应面分析法优化了工艺参数，在优化培养条件下，发酵时间36 h，枯草芽孢杆菌活菌数量达到5.35 x109 CFU / g。本发明为固态发酵制备替代抗生素的饲料益生菌剂提供了基础数据，同时对我国北方地区粮油副产物的综合利用和资源开发具有重要意义。CGMCC No.966020140915
【IPC分类】A23K1-18, C12R1-125, C12N1-20, A23K1-17
【公开号】CN104651270
【申请号】CN201510017923
【发明人】徐速, 江连洲, 于殿宇, 孙立斌, 孙慧, 赵清霞, 李相昕
【申请人】东北农业大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年1月14日