一种木聚糖酶、其编码基因xyn-lxy及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种木聚糖酶、其编码基因xyn-lxy及其应 用。
【背景技术】
[0002] 木聚糖是植物细胞壁半纤维素的主要成分，在自然界含量丰富，无论在人类日常 饮食中还是在畜禽日粮组成上，植物性纤维都占据了相当大的比例。但是人体以及单胃动 物消化道内缺少降解半纤维素的酶，无法对木聚糖进行有效的降解，因而增加了消化道食 糜的黏性，干扰小肠绒毛对营养物质的吸收和利用。反刍动物瘤胃内含有大量的微生物，对 木聚糖具有一定的降解能力，是获取新型木聚糖酶的重要发掘源。目前已经从瘤胃内分离 获得大量编码木聚糖酶基因的微生物，但是只有活性高、稳定性好的木聚糖酶应用到工业 生产中，以达到提高饲料转化率和改善动物生长性能的目的。而近年来的研究发现，木聚糖 酶的水解产物--低聚木糖对人体健康有着重要的意义，在消化道内可激发双歧杆菌和乳 酸菌大量增殖，抑制肠道腐败菌的生长，改善肠道微生态环境，从而增强机体的免疫力。除 此之外，低聚木糖还具有的难消化、热量低的特性，在机体代谢过程中不易转成脂肪和胆固 醇，降低了心脑血管疾病突发的可能性。因此低聚木糖在功能性保健品的应用上具有较大 的开发空间。
[0003] 通常木聚糖酶的水解产物含有木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖，木 糖的产量决定了木聚糖酶是否具有生产低聚木糖的开发价值，液相色谱法能够利用物质在 载体和固定相中分配系数的差别来将其高效、高速分离，这为检测木聚糖酶水解产物和测 定酶解效率提供了保障，能准确评估木聚糖酶在功能性保健品行业中应用前景。由于酶解 产物的多样性及木糖产量原因，目前市场上还没有专门生产低聚木糖的酶（系）供应。因 此，寻找活性良好、低聚木糖产量高的木聚糖酶基因尤为重要。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种木聚糖酶基因，其原核表达后水解产物只有木二糖和木糖，较为 单一，且木二糖的产量高，能降工业生产的成本。
[0005] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0006] 一种木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示。
[0007] -种编码所述木聚糖酶的木聚糖酶基因xyn-lxy，其核苷酸序列如SEQIDNo. 1所 示。本发明木聚糖酶基因xyn-lxy克隆自湖羊瘤胃微生物Fosmid文库，具有高效产功能性 低聚木糖功能。高效液相色谱检测其酶解产物主要是木二糖和木糖，未检测到其它低聚木 糖，其中木二糖的酶解效率每U可生产0. 25100mg，是木糖产率的3. 33倍，产物单一、木二糖 产率高是该酶的优势。
[0008] -种包含所述木聚糖酶基因xyn-lxy的重组载体。
[0009] -种包含所述木聚糖酶基因xyn-lxy的转基因细胞系。
[0010] -种包含所述木聚糖酶基因xyn-lxy的重组菌。
[0011] 一种制备木聚糖酶的方法，是发酵培养所述的重组菌，得到木聚糖酶。
[0012] 一种所述的重组菌在制备饲料添加剂中的应用。
[0013] 扩增所述木聚糖酶基因xyn-lxy采用的特异性引物为：LXY_F:5'CCG GAATTCATGATCTTCGCCCAGTGCGG3'，其核苷酸序列如SEQIDNo. 3 所示，LXY-R: 5'CCGCTCGAGTTATACCAGCTTGGCGTTACCAA3'，其核苷酸序列如SEQIDNo. 4。
[0014] 本发明所述木聚糖酶基因xyn-lxy的获取方法如下：
[0015] a、木聚糖酶基因xyn-lxy的克隆及重组质粒pET-30a/xyn_lxy的构建；
[0016] b、重组质粒pET-30a/xyn_lxy在大肠杆菌BL21 (DE3)中的表达；
[0017]c、重组蛋白Xyn-LXY的诱导、纯化及酶学特性分析；
[0018] d、重组酶Xyn-LXY水解产物高效液相色谱分析。
[0019] 作为优选，步骤a木聚糖酶基因xyn-lxy的克隆及重组质粒pET-30a/xyn_lxy的 构建过程具体如下：
[0020] ①PCR扩增木聚糖酶编码基因xyn-lxy;
[0021] ②限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切目的片段和表达载体pET_30a;
[0022] ③构成重组质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞。
[0023] 本发明所克隆的基因来自湖羊瘤胃微生物Fosmid文库，保证基因的新颖性。本发 明进行PCR扩增目的片段时采取的是自行设计的特异性引物，可以有效保证扩增效率和产 物特异性；本发明进行了酶的定量分析并将酶解时间延长至96h，能准确计算出酶解效率 和生产低聚木糖的最佳时间。
[0024] 本发明的木聚糖酶96h水解产物只有木二糖和木糖，产物较单一，木二糖产量高， 生产功能性低聚木糖具有优势；该木聚糖酶反应速率快，仅需2h可使低聚木糖的生产效率 达到最商。
【附图说明】
[0025] 图1是xyn-lxy木聚糖酶基因的克隆及表达策略；
[0026] 图2是克隆xyn-lxyPCR产物；
[0027] 图3是重组蛋白Xyn-LXY的SDS-PAGE分析图；
[0028] 图4是重组蛋白Xyn-LXY的WesternBlot鉴定；
[0029] 图5是pH对Xyn-LXY酶活性的影响；
[0030] 图6是Xyn-LXY酶的pH稳定性；
[0031] 图7是温度对Xyn-LXY酶活性的影响；
[0032] 图8是Xyn-LXY酶的热稳定性；
[0033] 图9是木糖及标准低聚木糖的HPLC图谱；
[0034] 图10是Xyn-LXY酶解产物液相分析。
【具体实施方式】
[0035]下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发 明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落 入本发明保护范围。
[0036] 在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等 均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常 规方法。
[0037] 实施例：
[0038] 一、xyn-lxy基因的克隆及重组质粒pET-30a/xyn_lxy的构建
[0039] xyn-lxy木聚糖酶基因的克隆及表达策略如图1所示，方法如下：
[0040] ①设计含有EcoRI和XhoI两个限制性酶切位点的引物：
[0041] LXY-F:5,CCGGAATTCATGATCTTCGCCCAGTGCGG3'，核苷酸序列如SEQIDNo. 2 所 示，
[0042] LXY-R:5'CCGCTCGAGTTATACCAGCTTGGCGTTACCAA3'，核苷酸序列如SEQIDNo. 3 所 /_J、i〇
[0043] ②PCR扩增Fosmid文库中含xyn-lxy基因的阳性质粒，扩增体系如下：
[0044]
【主权项】
1. 一种木聚糖酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2. -种编码权利要求1所述木聚糖酶的木聚糖酶基因其特征在于：其核苷酸 序列如SEQ ID No. 1所示。
3. -种包含权利要求2所述木聚糖酶基因?的重组载体。
4. 一种包含权利要求2所述木聚糖酶基因?的转基因细胞系。
5. -种包含权利要求2所述木聚糖酶基因?的重组菌。
6. -种制备木聚糖酶的方法，是发酵培养权利要求5所述的重组菌，得到木聚糖酶。
7. -种权利要求5所述的重组菌在制备饲料添加剂中的应用。
8. 扩增权利要求2所述木聚糖酶基因采用的特异性引物为：LXY-F :5 ' CCGGAATTCATGATCTTCGCCCAGTGCGG 3'，其核苷酸序列如 SEQ ID No. 3 所示， LXY-R ： 5，CCGCTCGAG TTATACCAGCTTGGCGTT ACCAA 3'，其核苷酸序列如 SEQ ID No. 4。
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，具体涉及一种木聚糖酶、其编码基因xyn-lxy及其应用。一种编码所述木聚糖酶的木聚糖酶基因xyn-lxy，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。发明人通过设计引物成功将其克隆，并在原核表达系统中成功表达，经诱导超声纯化所得的产物与山毛榉木聚糖反应，酶解产物液相色谱分析结果显示，反应96h后，产物只有木二糖和木糖。在反应开始时有木三糖出现，但反应至4h时完全被降解，木二糖和木糖的酶解效率最后稳定在0.25100mg/U和0.07559 mg/U。Xyn-LXY木聚糖酶的水解产物主要是木二糖，且产量高，在工业上非常适合作为功能性保健品开发的工具。
【IPC分类】C12N15-70, C12N15-11, C12N1-21, C12N15-56, A23K1-16, C12N9-42
【公开号】CN104651337
【申请号】CN201510041884
【发明人】王佳堃, 罗阳, 何波, 刘建新
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年1月28日