靶向pcsk9基因的脂质配制的dsrna的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2010年06月15日和发明名称为"靶向PCSK9基因的脂质配制 的DSRNA"的201080032102. 1号发明专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及包含靶向PCSK9基因的脂质配制的dsRNA的组合物和治疗由PCSK9基 因表达引起的疾病的方法。
[0003] 相关申请的夺叉引用
[0004]本申请要求于2009年6月15日提交的美国临时申请第61/187, 169号、于2009年 6月18日提交的美国临时申请第61/218, 350号、于2009年9月22日提交的美国临时申 请第61/244, 790号、于2009年12月11日提交的美国临时申请第61/285, 598号、于2010 年1月8日提交的美国临时申请第61/293, 474号和于2010年3月12日提交的美国临时 申请第61/313, 578号的优先权，所有这些临时申请的内容均为了所有目的通过引用整体 并入本文。
[0005] 序列表引用
[0006] 本申请包括以2010年X月XX日创建的、大小为XXX，XXX字节、名称为16733US_ sequencelisting,txt的文本文件形式电子提交的序列表。该序列表通过引用并入本文。
【背景技术】
[0007]枯草溶菌素前蛋白转化酶 9(Proproteinconvertasesubtilisinkexin 9，PCSK9)是枯草溶菌素丝氨酸蛋白酶家族的成员。其它8个哺乳动物枯草溶菌素蛋 白酶PCSK1-PCSK8(也被称为PC1/3、PC2、弗林蛋白酶、PC4、PC5/6、PACE4、PC7 和S1P/ SKI-1)是加工分泌通路中的多种蛋白质并在多种生物进程中发挥作用的前蛋白转化 酶（Bergeron,F. (2000)J.Mol.Endocrinol. 24, 1 - 22,Gensberg，K.，（1998)Semin.Cell Dev.Biol. 9, 11 - 17,Seidah,N.G. (1999)BrainRes. 848, 45 - 62,Taylor,N.A. , (2003) FASEBJ. 17, 1215 - 1227,和Zhou,A. , (1999)J.Biol.Chem. 274, 20745 - 20748)。现已提 出PCSK9在胆固醇代谢中发挥作用。PCSK9mRNA的表达在小鼠中由于胆固醇膳食饲养而 下调（Maxwell,K.N., (2003)J.LipidRes. 44, 2109-2119)，在H印G2 细胞中被他汀类药物 上调（Dubuc,G.，（2004)Arterioscler.Thromb.Vase.Biol. 24, 1454-1459)，而在固醇调节 元件结合蛋白（SREBP)转基因小鼠中上调（Horton,J.D.，（2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100, 12027-12032)，这类似于胆固醇生物合成酶以及低密度脂蛋白受体（LDLR)。此外，现已 发现PCSK9错义突变与常染色体显性高胆固醇血症形式（Hchola3)相关（Abifadel，M.等 人（2003)Nat.Genet. 34, 154-156,Timms,K.M. , (2004)Hum.Genet. 114, 349-353,Leren,T. P. (2004)C1in.Genet. 65, 419-422)。因为现已在日本人群体中发现单核苷酸多态性 (SNP)与胆固醇水平相关，因此PCSK9可能还在决定普通人群的LDL胆固醇水平中起作用 (Shioji，K.，（2004)J.Hum.Genet. 49, 109-114)。
[0008] 常染色体显性高胆固醇血症（ADH)是单基因疾病，其患者表现为升高的总胆固醇 水平和LDL胆固醇水平、肌腱黄色瘤和过早的动脉粥样硬化（Rader，D.J.，（2003)J.Clin.Invest. 111，1795-1803)oADH及隐性形式--常染色体隐性高胆固醇血症仏冊）（(：〇11611，了. C.，（2003)Curr.Opin.Lipidol. 14, 121-127)的发病机理是由于肝脏对LDL吸收的缺陷。阻 碍LDL吸收的LDLR突变或LDL上与LDLR结合的载脂蛋白B的突变均可导致ADH。ARH是 由ARH蛋白质中的突变造成的，ARH蛋白质是通过与网格蛋白相互作用而胞吞LDLR-LDL复 合物所必需的。因此，如果PCSK9突变是Hchola3家族病的病因，那么PCSK9很可能在受体 介导的LDL吸收中起作用。
[0009] 过表达研究指出PCSK9在控制LDLR水平并因此在控制肝脏对LDL的吸收中的作用 (Maxwell,K.N. (2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA101，7100-7105,Benjannet，S?等人（2004) J.Biol.Chem. 279, 48865-48875,Park,S.ff. , (2004)J.Biol.Chem. 279, 50630-50638) 〇 小 鼠中由腺病毒介导的小鼠或人PCSK9过表达3或4天可导致总胆固醇水平和LDL胆固 醇水平的升高，而在LDLR敲除动物中则未发现此作用（Maxwell,K.N. (2004)Proc.Natl. Acad.Sci.USA101, 7100 - 7105,Benjannet,S.,etal. (2004)J.Biol.Chem. 279, 48865 -48875,Park,S.W. , (2004)J.Biol.Chem. 279, 50630 - 50638)。此外，PCSK9 过表达造成肝脏 LDLR蛋白质的大量减少，但不影响LDLRmRNA水平、SREBP蛋白质水平或SREBP蛋白的细胞 核/细胞质比例。
[0010]PCSK9功能缺失突变已在小鼠模型中设计出来（Rashid等人，（2005) PNAS，102, 5374-5379)，并在人类个体中得到鉴定（Cohen等人，（2005)，Nature Genetics.，37, 161-165)。在这两种情况下，PCSK9功能缺失均导致总胆固醇水平和 LDLc胆固醇水平的降低。回顾过去15年的研究成果发现，缺失一个拷贝的PCSK9可 降低LDLc水平，并导致对抗心血管疾病风险的能力提高（Cohen等人，2006N.Engl. J.Med.，354.，1264-1272)。
[0011] 最近已发现双链RNA分子（dsRNA)通过被称为RNA干扰（RNAi)的高度保守的 调控机制来阻断基因表达。W0 99/32619 (Fire等人）公开了长度为至少25个核苷酸 的dsRNA在抑制秀丽隐杆线虫（C.elegans)基因表达中的应用。现还发现dsRNA在其它 生物体中降解靶RNA，其中所述生物体包括植物（参见，例如W0 99/53050,Waterhouse 等人和W099/61631,Heifetz等人）、果蝇（参见，例如Yang,D.等人，Curr.Biol. (2000) 10:1191-1200)和哺乳动物（参见TO00/44895,Li_er和DE101 00 586. 5,Kreutzer等人）。这种天然机制现已成为开发用于治疗因基因异常或有害调控而引 发的疾病的新型药物的研发热点。
[0012] 关于靶向？051(9的811?隱的说明可见美国专利7,605,251和恥2007/134161。其 他公开内容可见美国专利申请公开第2010/0010066和W0 2009/134487。
【发明内容】
[0013] 如以下详述，本文公开了包含靶向PCSK9的脂质配制的siRNA(例如靶向PCSK9的 MC3配制的siRNA)的组合物。还公开了使用该组合物抑制PCSK9表达和治疗与PCSK9表达 相关的疾病例如高脂血症的方法。
[0014] 因此，本发明的一个方面是包含核酸脂质颗粒的组合物，该核酸脂质颗粒包含用 于抑制细胞中人PCSK9基因表达的双链核糖核酸（dsRNA)，其中该核酸脂质颗粒包含脂质 制齐U，该脂质制剂包含45-65mol%的阳离子脂质、5mol%至大约lOmol%的非阳离子脂质、 25-40mol%的固醇和0? 5-5mol%的PEG或PEG修饰的脂质，所述dsRNA由有义链和反义链 组成，并且有义链包含第一序列且反义链包含与SEQIDN0:1523(5'-UUCUAGACCUGUUUUGC UU-3'）的至少15个连续核苷酸互补的第二序列，其中所述第一序列与第二序列互补，并且 其中所述dsRNA的长度为15-30个碱基对。
[0015] 如本文所述，所述组合物包含阳离子脂质。在一个实施方案中，阳离子脂质包含 MC3 (((6Z，9Z，28Z，31Z)-三十七碳-6, 9, 28, 31-四烯-19-基 4-(二甲基氨基）丁酸酯。例 如，脂质制剂可选自下组：
【主权项】
1. 一种包含核酸脂质颗粒的组合物，所述核酸脂质颗粒包含用于抑制细胞中人PCSK9 基因表达的双链核糖核酸（dsRNA)，其中 ： 所述核酸脂质颗粒包含脂质制剂，该脂质制剂包含45-65mol %的阳离子脂质、5mol % 至大约10mol%的非阳离子脂质、25-40mol%的固醇和0·5-5mol%的PEG或PEG修饰的脂 质， 所述dsRNA由有义链和反义链组成，并且有义链包含第一序列且反义链包含与SEQ ID N0:1523(5' -UUCUAGACCUGUUUUGCUU-3'）的至少15个连续核苷酸互补的第二序列， 其中所述第一序列与所述第二序列互补，并且其中所述dsRNA的长度为15-30个碱基 对。
2. 如权利要求1所述的组合物，其中所述阳离子脂质包含 MC3 (((6Z，9Z，28Z，31Z)-三十七碳-6, 9, 28, 31-四烯-19-基 4-(二甲基氨基）丁酸酯。
3. 如权利要求2所述的组合物，其中所述阳离子脂质包含MC3,并且所述脂质制剂选自 下组：
〇
4. 如权利要求1所述的组合物，其中所述阳离子脂质包含式A，其中式A为
其中RJP R 2独立为烷基、烯基或炔基，各自可以任选地被取代，且R 3和R 4独立为低级 烷基，或者馬和R 4可以一起形成任选取代的杂环。
5. 如权利要求4所述的组合物，其中所述阳离子脂质包含XTC(2, 2-二亚油基-4-二甲 基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环）。
6. 如权利要求4所述的组合物，其中所述阳离子脂质包含XTC，所述非阳离子脂质包含 DSPC，所述固醇包含胆固醇，且所述PEG脂质包含PEG-DMG。
7. 如权利要求4所述的组合物，其中所述阳离子脂质包含XTC并且所述制剂选自下 组：
O
8. 如权利要求1所述的组合物，其中所述阳离子脂质包含 ALNY-IOO ((3aR, 5s, 6aS) -N, N-二甲基-2, 2-二（(9Z, 12Z)-十八碳-9, 12-二烯基）四 氢-3aH-环戊二烯并[d] [1，3]二氧杂环戊烯-5-胺））。
9. 如权利要求8所述的组合物，其中所述阳离子脂质包含ALNY-100并且所述制剂由以 下组成：
〇
10. 如权利要求1所述的组合物，其中所述有义链包含SEQ ID NO: 1227且所述反义链 包含 SEQ ID NO: 1228。
【专利摘要】本发明涉及使用靶向PCSK9基因的脂质配制的siRNA的组合物和方法。
【IPC分类】A61P3-06, A61P35-00, A61K31-713, A61K48-00, C12N15-88, A61K9-127, A61P9-10, C12N15-113
【公开号】CN104651408
【申请号】CN201510020286
【发明人】K·菲吉拉德, G·辛克尔, A·阿金克, S·米尔斯泰恩
【申请人】阿尔尼拉姆医药品有限公司
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2010年6月15日
【公告号】CA2764832A1, CN102458366A, CN102458366B, EP2442792A2, US8273869, US8598139, US20110015252, US20130035371, US20140121263, WO2010148013A2, WO2010148013A3