立克次体甄别检测基因芯片的制备和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及立克次体甄别检测基因芯片的制备和用途，属于基因芯片检测技术领 域。
【背景技术】
[0002] 立克次体（rickettsiae)是一类除极少数外专性细胞内寄生的革兰氏阴性菌，其 引起的立克次体病是一类重要的人畜共患的自然疫源性疾病，在世界范围内呈散发性和季 节性流行。许多节肢动物如虱、蚤、蜱、螨等均可作为立克次体感染的传播媒介。随着国际 旅游业的发展，立克次体病被认为是威胁旅游健康的重要传染病之一。近些年来，斑点热新 种的不断出现，埃立克体等新发立克次体的流行，都在提醒我们立克次体病大规模流行和 突然暴发的可能性。此外立克次体作为潜在的生物恐怖病原体，也日益受到重视，美国反对 生物恐怖主义（Bioterrorism)已将流行性斑疹伤寒、落基山斑点热以及Q热列在生物战剂 名录中。因此，加强立克次体的监测与防治具有重要的现实意义。
[0003]目前世界范围内已发现具有致病性的立克次体有20余种，病人分离出的病原体 以及基因检测证据表明我国至少存在10种立克次体病。立克次体病早期症状多样，无特异 性临床特征，临床误诊率极高。延误治疗可引起严重的并发症，甚至死亡。但是若能在感染 早期做出正确的诊断，低廉、有效的强力霉素及四环素即可对立克次体有效。因此快速、准 确的早期诊断是控制立克次体病的关键。传统的立克次体检测方法主要有分离培养、PCR 和免疫学诊断。但分离培养耗时长，操作复杂；PCR和免疫学方法只能检测一种或几种病原 体，不能完全满足检测种类多样的立克次体的需要。而基因芯片技术具有快速、准确、低成 本等特点特别适用于立克次体病的高通量检测。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于针对立克次体核酸高通量检测领域存在的一些不足，研制一种 高通量、特异、敏感、快速的立克次体甄别检测基因芯片，能同时检测七种重要的立克次体， 包括普氏立克次体、莫氏立克次体、斑点热群立克次体、贝氏柯克斯体、恙虫病东方体、查菲 埃立克体、嗜吞噬细胞无形体，为立克次体感染的临床诊断及流行病学调查提供一种新的 检测手段。
[0005] 为了达到上述目的，本发明立克次体甄别检测基因芯片，其制备方法如下：
[0006] 1.步骤一：制备立克次体属通用及特异性引物
[0007] 选择立克次体属的ompB基因、贝氏柯克斯体icd基因、恙虫病东方体47-KDa基 因、嗜吞噬细胞无形体ankA基因、查菲埃立克体trp-120基因等作为检测靶基因，可以实现 7种立克次体靶基因片段的扩增。优选6对引物序列及其对应的扩增靶标，如表1所示：
[0008] 表1引物序列及对应的扩增靶标
[0009]
【主权项】
1. 一种甄别检测七种立克次体的基因芯片，本发明的基因芯片可以用于同时甄别普 氏立克次体、莫氏立克次体、斑点热群立克次体、贝氏柯克斯体、恙虫病东方体、查菲埃立克 体、嗜吞噬细胞无形体。其特征是包含检测立克次体的12条通用及特异性引物；8条立克 次体特异性寡核苷酸探针；1条立克次体属通用探针；1条片基质控探针和1条阴性对照探 针和载体。上述探针分别分布在载体上。 表1立克次体属通用扩增引物
表2贝氏柯克斯体扩增引物
表3恙虫病东方体扩增引物
表4嗜吞噬细胞无形体扩增引物
表5查菲埃立克体扩增引物
表6立克次体特异性寡核苷酸探针序列
2. 根据权利1所述的立克次体甄别检测基因芯片，其特征是所述的载体为醛基化修饰 的玻璃片、硅片、聚苯乙烯基片、尼龙基片。
3. -种立克次体甄别检测基因芯片的制备方法，包括以下步骤： 步骤一，探针和引物的设计：首先从NCBI基因数据库中下载立克次体基因序列，序列 下载完成后，使用Vector NTI Advance lO(invitrogen)软件包中的AlignX程序按照默认 的参数设置对各病原体基因序列进行全局比对。根据比对结果在基因序列的保守位置设计 特异性寡核苷酸探针、特异性引物。 步骤二，探针的合成，每条探针的3'端加入12个碱基T且3'末端T氨基修饰作为连 接臂，以使其能固定在醛基化修饰玻璃基片上；质控探针除3'末端T进行氨基修饰外，5'端 同时标记生物素标记； 步骤三，芯片的制备：将合成后的探针用去离子水稀释成100 μ M，分别取10 μ L探针溶 液，和10 μ L体积芯片点样液混匀，使探针点样终浓度为50 μ Μ，装于384孔板，将芯片表面 贴上10样品孔阵列膜，用Pixsys 5000芯片制备仪（Cartesian Technologies)，采用接触 式点样方式，将探针点制在载体上，点样过程中保持一定湿度，点样完成后将芯片置于干燥 器中避光常温静置48h，使探针和芯片表面醛基脱去1分子水后共价结合，点制好的芯片常 温干燥保存。
4. 根据权利要求3所述的立克次体甄别检测基因芯片的制备方法，其特征是步骤一中 10条特异性寡核苷酸探针及12条引物，探针长度在20-37nt，引物长度在18-25nt。
5. 根据权利要求3所述的立克次体甄别检测基因芯片的制备方法，其特征是步骤三种 所述的载体为醛基化玻璃片基或硅片、聚苯乙烯基片、尼龙基片。
6. 立克次体甄别检测基因芯片的使用方法，其特征是包括以下步骤： 1) 步骤一，立克次体基因组DNA的提取，使用市售商品化细菌基因组DNA提取试剂盒提 取立克次体基因组DNA ; 2) 步骤二，多重不对称PCR扩增：扩增使用TaKaRa公司的PCR试剂，将整个扩增体系 分为A、B两管。A管包括莫氏立克次体、普氏立克次体、斑点热群立克次体、查菲埃立克体； B管包括贝氏柯克斯体、恙虫病东方体、嗜吞噬细胞无形体。扩增按以下循环参数进行扩增： 95°〇预变性2!1^11;951：2〇8,551：2〇8,721：，2〇8，共45个循环 ；721：延伸51^11;41：保存或 进行下一步实验； 3) 步骤三，芯片杂交：将基因芯片分别置0.2% SDS和去离子水中分别清洗30s，离心 干燥；将步骤二得到的扩增产物在95°C变性5min后立即置于冰浴中5min，取变性的A管产 物2. 5 μ L和B管产物2. 5 μ L与5 μ L杂交液混匀，使用加样器加于芯片加样孔使其均匀覆 盖于阵列表面，将基因芯片放入杂交盒内在45°C杂交Ih ; 4) 步骤四，杂交后清洗基因芯片：基因芯片杂交完成后，从杂交盒中取出芯片，并立即 依次在洗液1\350+0.2%505、0.2父55(：和0.1\55(：中各清洗305，最后将基因芯片表面 液体离心干燥； 5) 步骤五，样品标记：向芯片加入15 μ 1标记液，用移液器涂勾后将芯片放回杂受盒中 置37°C水浴中反应30min，取出芯片以PBST清洗10s，离心干燥； 6) 步骤六，扫描：向芯片反应区加入刚刚I : 1混合的发光液A和B的混合溶液，用移 液器涂匀后立即置化学发光成像仪中扫描，成像模式为触发模式，曝光参数511，增益参数 300,曝光时间10s，触发次数1次； 7) 步骤六，数据分析：成像结束后使用化学发光分析软件进行芯片探针信号分析。每 条探针的信号取其三个重复点的平均值，根据探针Cutoff值，探针信号值>该探针Cutoff 值的判读为该探针信号阳性。本发明使用方法的步骤二中PCR使用的反向引物修饰分子为 生物素。本发明使用方法步骤三中使用的杂交液组分为8XSSC，0. 6% SDS，10%甲酰胺， 10XDenhardt。
7. 根据权利要求6所述的立克次体甄别检测基因芯片的使用方法，其特征是步骤二中 使用的用于扩增立克次体各特异性基因的反向引物5'端进行修饰。
8. 根据权利要求7所述的反向引物5'端修饰分子可以是CY3、CY5、生物素。
9. 根据权利要求6所述的立克次体甄别检测基因芯片的使用方法，其特征是步骤三中 使用的杂交液组分为8 X SSC，0. 6 % SDS，10 %甲酰胺，10 X Denhardt。
10. 根据权利要求6所述的立克次体甄别检测基因芯片的使用方法，其特征是步骤六 中使用的扫描方法，根据权利要求8中反向引物修饰分子的不同，扫描方法包括突光扫描， 可视化扫描，化学发光成像。
【专利摘要】本发明涉及一种立克次体甄别检测基因芯片的制备和用途，其制备方法包括制备通用及特异性引物，制备七种立克次体核酸分型探针，制备寡核苷酸芯片，建立多重PCR体系，建立杂交体系。利用本发明制备的基因芯片可同时甄别七种重要的立克次体，包括普氏立克次体、莫氏立克次体、斑点热群立克次体、贝氏柯克斯体、恙虫病东方体、查菲埃里克体、嗜吞噬细胞无形体。该基因芯片具有快速、准确、高通量、特异性高的优势，可为立克次体感染的临床诊断及流行病学调查提供一种新的检测手段。
【IPC分类】C12Q1-04, C12R1-01, C40B50-06, C12Q1-68, C40B40-06
【公开号】CN104651498
【申请号】CN201510033678
【发明人】王升启, 李灵云, 刘琪琦, 陈苏红, 张敏丽, 张英杰
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年1月23日