一种利用微卫星标记鉴定青虾家系的引物组及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用微卫星标记鉴定青虾家系的引物组及方法，属于虾类育种和 分子标记技术领域。
【背景技术】
[0002] 青奸，学名日本沼奸（Macrobrachiumnipponense)，俗称河奸，具有繁殖力高，适 应性强，食性广，肉味鲜美，可常年上市等优点。当前全国养殖青虾年产量超过23万吨，年 产值近200亿元，青虾养殖已在我国水产养殖中发挥了举足轻重的作用。但目前养殖的青 虾大多数为未经系统遗传选育的野生种在池塘多代养殖的后代，随着青虾养殖业的高速增 长，集约化程度的不断提高，近年来出现了严重的品种退化现象，严重制约了青虾养殖业的 发展。要实现青虾养殖的可持续发展，必须从品种着手，对青虾进行遗传改良。在青虾的选 育工作中，为避免近亲交配造成后代生活力降低和种质退化等，对青虾的亲子鉴定就显得 尤为迫切，但是目前还没有鉴定青虾亲子关系的有效方法，传统区分家系的方法是在眼柄 上绑定眼柄标记，不但耗费人力物力，而且绑定不适用于幼虾，在幼虾长到足够大之前仍需 要一段时间的分池饲养，因此建立一种青虾亲子关系鉴定的方法具有极其重要的理论和生 产意义。
[0003] 微卫星标记据有多态性高、稳定性强、特异性高、共显性遗传等优点，为水产动物 选育中保持家系信息、确认亲缘关系、追踪系谱提供了有用的工具。如果已知父母的基因 型，微卫星标记能在没有物理标记且不需要分开养殖的情况下区分出现混养的群体中个体 所属的家系。有关研究（Vandeputteetal.2004;Jerryetal.2006;董世瑞等2008;Wang etal. 2009)证实了微卫星在水产动物研究中确认父母本和分析家系关系中的应用价值。 目前尚未有将微卫星标记应用于青虾家系鉴定的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种利用微卫星标记鉴定青虾家系的引物组及方法，该方法 需要具有鉴别准确率高、不需将各子代分开放养等优点，主要是通过青虾微卫星位点进行 PCR扩增和基因分型检测来实现。
[0005] 技术方案：
[0006] 根据本发明的一个方面，一种利用微卫星标记鉴定青虾家系的引物组，包括有用 于扩增如下12个微卫星位点的引物对：WXM02、WXM04、WXM05、WXM06、WXM07、WXM13、WXM31、 WXM33、WXM38、WXM41、E-WXM33 和E-WXM62。
[0007] 所述的引物对的序列如下所示：WXM02,SEQIDNO. 1~2、WXM04,SEQIDN0. 3~ 4、WXM05,SEQIDNO. 5 ~6、WXM06,SEQIDNO. 7 ~8、WXM07,SEQIDNO. 9 ~10、WXM13，SEQIDNO. 11 ~12、WXM31，SEQIDNO. 13 ~14、WXM33,SEQIDNO. 15 ~16、WXM38,SEQ IDNO. 17 ~18、WXM41，SEQIDNO. 19 ~20、E-WXM33,SEQIDNO. 21 ~22 和E-WXM62,SEQ IDNO. 23 ~24。
[0008] 根据本发明的另一个方面，一种利用微卫星标记鉴定青虾家系的方法，包括如下 步骤：
[0009] 第1步、提取青虾样本的DNA;
[0010] 第2步、使用引物组对青虾样本进行PCR扩增；
[0011] 第3步、对扩增产物进行电泳分析，利用电泳结果对青虾进行亲子鉴定。
[0012] 上述的PCR扩增中，采用25iiL反应体系，组成如下：其中10mmol/LdNTPliiL， 10Xbuffer2?5ilL，25mmol/LMgCl22ilL，8pmol/ilL两侧引物各0?75ilL，5UTaqDNA聚合 酶0. 2iiL，50ng/iiL的DNA模板2iiL，用超纯水补足25iiL。
[0013] ?〇?反应条件为：941：预变性5111111;941：变性308，复性308,721：458,30个循环； 最后72°C延伸7min;4°C保存。
[0014] 上述的第3步中，用10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测、EB染色10~ 15min，凝胶成像系统成像拍照。
[0015] 有益效果
[0016] 1.本发明可将不同家系自带混养在一起，不需要将各家系子代采用水族箱或水泥 池分开放养，可极大节省人力、物力和财力；2.本发明将不同家系子代放在一起混养，可避 免家系分开放养引入的环境误差，提高选育效果；3.本发明不需要对个体使用物理标记， 避免了物理标记存在的操作繁琐、易损伤幼虾、对生长造成一定影响、标记保存时间不长等 缺陷；4.
[0017] 本发明中所选的12对微卫星引物在青虾中PCR扩增反应稳定、扩增片段清楚、多 态性高，适用于青奸的亲子鉴定。
【具体实施方式】
[0018] 实施例1
[0019] (1)青虾家系的繁育
[0020] 从青虾天然群体中挑选了 10只母本和10只父本（实验中所用的青虾均为野生 成体青虾，全部采自太湖无锡湖区（120° 13'44〃E，31° 28'22〃沁），通过一雄对一雌的方 式繁育，为防止公虾攻击母虾导致母虾死亡，每一只母虾单独一个缸饲喂，待到母虾脱壳， 再将一只公虾放入该水缸完成交配，在观察到母虾抱卵后，将公虾采样，储存在95%的酒精 内，保存于_2〇°C。待虾卵孵化后，将母虾采样，储存于95%的酒精内，保存与-20°C。最终 得到3个家系，虾苗子代经染色后混养至第20日采样，得到子代与亲本共126只个体。
[0021] (2)青虾亲本和子代基因组DNA提取
[0022] 取青虫下肌肉组织（不超过0? 5g)于1. 5mLEppendorf管中，加入450iiLSTE抽提缓 冲液（10mmol/LTris-HCl，pH8.0;lmmol/LEDTA，pH8.0)、35iiL505(10%)、151^蛋白酶 K(0. 2% )。颠倒混匀后，将Eppendorf管放入55°C水浴锅中消化3h左右至溶液澄清透明。 加入RNaseA至终浓度20iig/ml，37°C温浴lh。加入700iiLTris饱和酚，在DNA混合仪上 振荡混匀30min，4°C下12000转/min离心10min，将上清液转移入另一个干净的eppendorf 管中。在上清液中加入等体积酚仿醇混合物（酚、氯仿、异戊醇比例为25 :24 :1)，振荡混 匀15min后，4°C下12000转/min离心10min，吸上清液于另一新Eppendorf管中。上清液 中加入等体积氯仿，振荡混匀15min后，4°C下12000转/min离心10min，吸取上清液。加 入-20°C预冷的无水乙醇lmL沉淀DNA，收集沉淀。用70%乙醇洗涤沉淀两次，干燥后加入200iiLTE(10mmol/LTris-HCl，pH8.0;0.1mmol/LEDTA，pH8.0)，室温充分溶解。每个DNA 样品加入lOmg/mLRNA酶1iiL，用NanoDropND-1000紫外分光光度仪检测DNA浓度和质量， 将各DNA样品稀释成100ng/yL的工作液。
[0023] (3)PCR引物的扩增反应及电泳检测
[0024] 从本实验室已开发的微卫星位点中选取30个微卫星位点（乔慧等，青虾分子标记 的开发应用及遗传连锁图谱的构建；周巧等，青虾高多态性EST-SSR标记的筛选及遗传多 样性的研究），扩增引物及条件如表1所示。PCR反应体系为25yL:10mmol/LdNTP1yL， 10Xbuffer2.L，25mmol/LMgC122iiL，8pmol/iiL两侧引物各0? 75iiL，5UTaqDNA聚合 酶0. 2iiL，50ng/iiL的DNA模板2iiL，用超纯水补足25iiL。PCR反应条件为：94°C预变性 5min;94°C变性30s，复性30s，72°C45s，30个循环；最后72°C延伸7min;4°C保存。
[0025]PCR产物用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，EB染色后用凝胶成像系统 成像拍照。
[0026]表1
[0027]
【主权项】
1. 一种利用微卫星标记鉴定青虾家系的引物组，其特征在于，包括有用于扩增如下12 个微卫星位点的引物对：WXM02、WXM04、WXM05、WXM06、WXM07、WXMl3、WXM31、WXM33、WXM38、 WXM41、E-WXM33 和 E-WXM62。
2. 根据权利要求1所述的利用微卫星标记鉴定青虾家系的引物组，其特征在于：所述 的引物对的序列如下所示：WXM02，SEQ ID NO. 1 ~2、WXM04，SEQ ID NO. 3 ~4、WXM05， SEQ ID NO. 5 ~6、WXM06, SEQ ID NO. 7 ~8、WXM07, SEQ ID NO. 9 ~10、WXM13，SEQ ID N0.11~12、WXM31，SEQIDN0.13~14、WXM33，SEQIDN0.15~16、WXM38，SEQID NO. 17 ~18、WXM41，SEQ ID NO. 19 ~20、E-WXM33，SEQ ID NO. 21 ~22 和 E-WXM62，SEQ ID NO. 23 ~24。
3. -种利用微卫星标记鉴定青虾家系的方法，其特征在于，包括如下步骤：第1步、提 取青虾样本的DNA ;第2步、使用权利要求1或2所述的引物组对青虾样本进行PCR扩增； 第3步、对扩增产物进行电泳分析，利用电泳结果对青虾进行亲子鉴定。
4. 根据权利要求1所述的利用微卫星标记鉴定青虾家系的方法，其特征在于：上述的 PCR扩增中，采用25μL反应体系，组成如下：其中lOmmol/LdNTP lPL，10Xbuffer 2.5μL， 25mmol/L MgCl2 2PL，8pmol/^L 两侧引物各 0· 75PL，5U TaqDNA 聚合酶 0· 2PL，50ng/^L 的 DNA模板2μL，用超纯水补足25μL。
5. 根据权利要求1所述的利用微卫星标记鉴定青虾家系的方法，其特征在于：PCR反 应条件为：94°C预变性5min;94°C变性30s，复性30s，72°C 458,30个循环；最后721：延伸 7min ;4°C 保存。
6. 根据权利要求1所述的利用微卫星标记鉴定青虾家系的方法，其特征在于：上述的 第3步中，用10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测、EB染色10~15min，凝胶成像系 统成像拍照。
【专利摘要】本发明涉及一种利用微卫星标记鉴定青虾家系的引物组及方法，属于青虾的育种技术领域。其步骤包括：采用人工繁育的方法繁育青虾家系；采集待鉴定的青虾样品，提取基因组DNA；获得的基因组DNA为模板，选取筛选出的12对微卫星引物进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行电泳检测；将电泳结果进行数字化处理，用遗传分析软件进行亲子鉴定。本发明可以快速准确地对青虾进行亲子鉴定，区别不同家系，可以减少在青虾群体选育中存在的近亲繁殖现象更有利于实现家系选育，从而加快选育的进程，提高选育效果。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104651514
【申请号】CN201510084807
【发明人】傅洪拓, 吕洋, 乔慧, 张文宜, 蒋速飞, 熊贻伟, 龚永生, 金舒博, 梁国霞, 白洪坤, 颜跃弟
【申请人】中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月16日