用于禽流感病毒检测的rt-lamp引物组、试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及禽流感病毒的检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 禽流感（AvianInfluenza,AI)又称"真性鸡瘟"或"欧洲鸡瘟"，是由禽流感病毒 (AvianInfluenzavirus,AIV)引起的禽类传染病。主要发生于鸡、鸭、鹅、纟鸟子等，人也可 感染。根据其临床表现，可分为高致病性、低致病性和非致病性禽流感。其中高致病性禽流 感因其传播快、危害大，被世界动物卫生组织列为A类动物疫病，我国将其列为一类动物疫 病。AIV检测方法主要包括：病毒分离、RT-PCR、实时荧光定量PCR。这些方法在病毒检测中 发挥了重要作用，但普遍存在操作繁琐、检测周期长、需要昂贵的仪器设备等缺点，不适用 于基层或现场的快速检测。
[0003]逆转录环介导等温扩增技术（ReverseTranscriptionLoop-Mediated IsothermalAmplification,RT-LAMP)专门用于快速扩增RNA。其基本原理是采用4或6 条特异引物和具有链置换功能的DNA聚合酶，在等温条件下对核酸进行扩增，不需要特殊 仪器设备，检验周期很短，在一小时内即可完成反应。反应完成后，只需通过其副产物白色 的焦磷酸镁沉淀来观察结果，或者预先加入荧光染料，通过肉眼观察就能判断结果。
[0004]RT-LAMP方法具有简便、快速、敏感、特异的优点，尤其适合在基层或现场进行快速 检测。RT-LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。目前亟需建立一 种能够灵敏、特异、高效检测禽流感病毒的RT-LAMP检测手段。
【发明内容】
[0005] 针对上述问题，本发明根据GenBank公布的禽流感病毒序列，在其M基因保守序列 区域设计了一套通用的RT-LAMP特异性引物，如表1所示。这些基因序列涵盖了多种家禽 及野鸟来源的禽流感病毒的M基因，具有普遍性和代表性。
[0006] 利用该引物建立的RT-LAMP检测对在我国主要存在的H5、H7和H9亚型禽流感 病毒以及新城疫病毒等其他4种禽病病原进行检测，结果表明该引物组仅能特异性扩增 禽流感病毒基因，而不能扩增其他病毒基因，具有很好的特异性。
[0007] 本发明所解决的技术问题之一是提供了一种用于禽流感病毒检测的RT-LAMP引 物组，其特征在于：所述引物组由一对外引物和一对内引物组成；所述外引物对序列为SEQ IDNo. 1和SEQIDNo. 2所示，所述内引物对序列为SEQIDNo. 3和SEQIDNo. 4所示。
[0008]将SEQIDNo. 1、SEQIDNo. 2、SEQIDNo. 3、SEQIDNo. 4 所对应的引物序列分 别命名为M-F3、M-B3、M-FIP、M-BIP。
[0009]所述引物143、]?-83、]\^71?、]\1-81?的摩尔比具体可为1:1 :5:5。
[0010] 在本发明的一个实施例中，所述一对外引物（M-F3和M-B3)在RT-LAMP反应体系 中的终浓度均为〇. 2iiM，所述一对内引物（M-FIP和M-BIP)在环介导等温扩增反应体系中 的终浓度均为1UM。
[0011] 本发明所解决的技术问题之二是提供了一种用于禽流感病毒检测的RT-LAMP试 剂盒，包括RT-LAMP反应液、链置换型DNA聚合酶和反转录酶，其特征在于还包括以上所述 的引物组。
[0012] 优选的，RT-LAMP反应液由 10XBstDNABuffer、MgC12、dNTPs、无核酸酶水组 成；链置换型DNA聚合酶为BstDNA聚合酶；反转录酶由AMV反转录酶与RNA酶抑制剂组 成。
[0013] 优选的，所述试剂盒还包括荧光显色剂、阳性对照和阴性对照。
[0014] 其中，阳性对照可为禽流感病毒样品；阴性对照可为灭菌超纯水。
[0015] 优选的，荧光显色剂可为含有钙黄绿素和MnC12的水溶液。
[0016] 优选的，所述试剂盒还包括提取RNA的试剂：TRIzolLSReagent、氯仿、异丙醇、 75%乙醇、无核酸酶水。
[0017]如下1)或2)的应用也属于本发明的保护范围： 1) 如上所述的引物组在制备所述试剂盒中的应用； 2) 所述引物组或所述试剂盒在制备检测待测样品中是否含有禽流感病毒的产品中的 应用。
[0018] 应用所述引物组或所述试剂盒检测待测样品中是否含有禽流感病毒的方法，包括 如下步骤： 1、病毒RNA的提取 采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取禽流感病毒的RNA。具体步骤如下： (1)将250iiL样本加入750iiLTRIzolLSRegent中，剧烈振荡2min，室温放置5 111；[11。加入 250 111^氯仿，剧烈振荡1111；[11，室温放置5111；[11后，41€ 12,000 印1]1离心15 111；[11， 将上层水相转入新的离心管。
[0019] (2)加入与水相等体积的异丙醇，混匀，室温静置15min，4°C12, 000rpm离心15 min,轻轻倒去上清，然后加入DEPC处理的75%乙醇800iiL，4°C12,000rpm离心5min,弃 上清。
[0020] (3)将沉淀自然风干或于50°C干燥箱中晾干，用适量无核酸酶的水充分溶解后立 即进行RT-LAMP或贮存于-80°C备用。
[0021] 2、RT-LAMP反应 在反应管中依次加入13iiLRT-LAMP反应液、6iiL引物组、2iiL上述RNA模板、1. 5iiL反转录酶、1.5iiLBstDNA聚合酶以及liiL荧光显色剂，制成25iiLRT-LAMP反应体系， 其中6iiL引物组由0. 5iiL浓度为10剛的M-F3、0. 5iiL浓度为10剛的M-B3、2. 5iiL浓 度为10剛的M-FIP、2. 5yL浓度为10剛的M-BIP组成。混匀后将反应管置于水浴锅中， 62°C保温 60min，80°ClOmin终止反应。
[0022] 3、检测 (1)直接观察：反应完成后立即观察反应液颜色变化。阳性样品反应液变为绿色，阴性 样品反应液保持橙黄色不变。
[0023] (2)离心检测：阳性样品反应后反应管浑浊，阴性样品反应后反应管澄清。4000rpm 离心5min后，阳性样品反应管可见白色的焦磷酸镁沉淀，阴性样品反应管无沉淀。
[0024] (3)电泳检测：用1%琼脂糖凝胶电泳检查RT-LAMP扩增产物。阳性反应呈现特有 的梯状条带，阴性反应则无条带出现。
[0025] 本发明使用荧光显色剂作为指示剂，通过肉眼观察反应液颜色就可以直接判定检 测结果，避免了打开反应管盖后引起环境污染而造成下次实验的假阳性结果。本发明只需 一个可控温的水浴锅即可完成全部反应，不需要贵重的热循环仪。RT-LAMP扩增速度快，可 在60min内获得结果；检测灵敏度高，比普通PCR敏感性高100倍。
[0026] 本发明可对死亡的家禽或野鸟的肠内容物、肺、气囊、肠、脾、肝和心等组织以及活 体家禽或野鸟气管拭子或泄殖腔拭子进行禽流感病毒检测，可供检测的对象范围广，适用 性强。
[0027] 本发明根据GenBank公布的禽流感病毒序列，在其M基因保守序列区域设计了一 套通用RT-LAMP特异性引物，这些基因序列涵盖了多种家禽及野鸟的M基因，具有普遍性 和代表性。利用该引物建立的RT-LAMP检测对在我国主要存在的H5、H7和H9亚型禽流 感病毒以及新城疫病毒等其他4种禽病病原进行检测，结果表明该引物组仅能特异性扩增 禽流感病毒基因，而不能扩增其他病毒基因，具有很好的特异性。
[0028] 本发明特异性强、敏感性高、仪器设备及操作简单、易于观察结果，尤其适合在基 层及现场的快速检测，具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0029] 图1为禽流感病毒RT-LAMP检测结果； M:DL2000;1:无核酸酶水；2:禽流感病毒； 图2为禽流感病毒RT-LAMP灵敏性检测结果； A:RT-PCR;B:RT-LAMP； 1:DL2000; 2: 100; 3:KT1; 4:KT2; 5:KT3; 6:KT4; 7:KT5; 8: 1(T6;9:1(T7;10: KT8; 图3为禽流感病毒RT-LAMP特异性检测结果。
[0030]M:DL2000; 1:H5; 2:H7; 3:H9; 4:新城疫病毒；5:传染性法氏囊病毒；6: 鸡传染性支气管炎病毒；7:鸡减蛋与呼吸综合征病毒。
【具体实施方式】
[0031] 下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所 给出的例子。下述实施例中所使用的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例 中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032] 实施例1以RT-LAMP法检测禽流感病毒的试剂盒最佳实施例 本实施例试剂盒包括以下RT-LAMP引物组，见表1。试剂盒分为A盒与B盒，A盒为RNA提取试剂盒，其试剂盒组成及保存条件见表2。B盒为禽流感病毒逆转录环介导等温扩增 (RT-LAMP)试剂盒，其试剂盒组成及保存条件见表3。
[0033]其中，RT-LAMP反应液由 50uL10XBstDNABuffer、50uL浓度为 25mM的MgC12 溶液，60uL浓度为2. 5mM的dNTPs溶液，120uL无核酸酶水组成。
[0034] 反转录酶由20uL浓度为200U/ML的AMV反转录酶与10uL浓度为50U/ML的RNA 酶抑制剂组成。
[0035] 荧光显色剂为含有钙黄绿素和MnCl2的水溶液。
[0036] 阳性对照为禽流感病毒样本，阴性对照为灭菌超纯水。
[0037] 引物为水溶液，由50uL浓度为10剛的M-BIP引物、50uL浓度为10剛的M-FIP引 物、10uL浓度为10剛的M-F3引物与10uL浓度为10剛的M-B3引物组成。
[0038] 表1禽流感病毒RT-LAMP引物
【主权项】
1. 一种用于禽流感病毒检测的RT-LAMP引物组，其特征在于：所述引物组由一对外引 物和一对内引物组成；所述外引物对序列为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，所述内引物 对序列为SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示。
2. -种用于禽流感病毒检测的RT-LAMP试剂盒，包括RT-LAMP反应液、链置换型DNA 聚合酶和反转录酶，其特征在于还包括权利要求1所述的引物组。
3. 根据权利要求2所述的用于禽流感病毒检测的RT-LAMP试剂盒，其特征在于所述 RT-LAMP反应液由10 X Bst DNA Buffer、MgCl2、dNTPs、无核酸酶水组成；所述链置换型 DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；所述反转录酶由AMV反转录酶与RNA酶抑制剂组成。
4. 根据权利要求2或3所述的用于禽流感病毒检测的RT-LAMP试剂盒，其特征在于： 所述试剂盒还包括荧光显色剂、阳性对照和阴性对照。
5. 根据权利要求4所述的用于禽流感病毒检测的RT-LAMP试剂盒，其特征在于：所述 荧光显色剂为含有钙黄绿素和MnCl2的水溶液。
6. 根据权利要求2或3所述的用于禽流感病毒检测的RT-LAMP试剂盒，其特征在于： 所述试剂盒还包括提取RNA的试剂：TRIzol LS Reagent、氯仿、异丙醇、75%乙醇、无核酸酶 水。
7. 如下1)或2)的应用： 1) 权利要求1所述的引物组在制备权利要求2所述试剂盒中的应用； 2) 权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的试剂盒在制备检测待测样品中是否 含有禽流感病毒的产品中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种用于禽流感病毒检测的RT-LAMP引物组、试剂盒及其应用。所述引物组由一对外引物和一对内引物组成，所述外引物对序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述内引物对序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，可有效检测禽流感病毒。该试剂盒包括前述引物，可用于检测禽流感病毒。本发明还提供了一种采用前述试剂盒进行禽流感病毒检测的方法，其检测结果可直观地根据反应液颜色变化判断，快速准确。本发明具有检测禽流感病毒特异性强、敏感性高、快速准确的特点，尤其适用于现场和基层的检测。
【IPC分类】C12R1-93, C12Q1-70, C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104651533
【申请号】CN201510077664
【发明人】袁万哲, 刘聚祥, 孙继国, 陈立功, 刘静, 王庚南
【申请人】河北农业大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月13日