泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种培养基，尤其是涉及一种泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基及 其应用。
【背景技术】
[0002] 支原体（Mycoplasma)是一类缺乏细胞壁、呈高度多形性、能通过0? 22um滤菌器、 可在无生命培养基中生长繁殖的最小原核细胞型微生物。支原体于1898年由Nocard等首 次分离出来，1956年正式命名为支原体（Mycoplasma)，在微生物分类中建立了一个新的独 立的纲一一柔膜体纲（Mollicutes)，并在近20年来迅速成为一门独立的微生物学的分支 学科，即支原体学（Mycoplasmology)。
[0003] 支原体是介于病毒与细菌之间微生物，目前已分离到150多种。与人类疾病 有关的主要有肺炎支原体（Mycoplasmapneumoniae,Mp)、解脲脲原体（Ureaplasma urealyticum,简称Uu)及人型支原体（Mycoplasmahominis,简称Mh)。Uu和Mh被国际公 认为泌尿生殖道感染（俗称"性病"）的重要病原体。
[0004] 支原体基因组小，一般仅是大肠杆菌的1/5~1/4,基因组中编码氨基酸和辅助因 子生物合成的基因极少；缺乏能量代谢途径中所需的许多重要基因，如厌氧代谢途径、电子 传递链、ED途径、发酵、糖异生和三羧酸循环等相关基因；对脂肪酸和磷脂代谢基因和调控 基因较少。因此，支原体是氨基酸、脂类和某些辅助因子营养缺陷型，很难对环境变化作出 调整，仅在特定环境中生存。支原体细胞小（小于l〇〇nm)且多形，有液体运动性；菌体集落 小于l-2mm，肉眼难见，通常借助40-100倍显微镜检查计数。因此，支原体生长繁殖的生理 生化相对简单而自然地依附宿主组织细胞并有胞内生存的特点，人工培养生长缓慢；Uu/Mh 种间差异大，可用于分离、鉴别。
[0005] 总之，支原体的特殊性，造成临床诊断、治疗的困难，同时是研发技术的关键点。
[0006] 具有数十年历史的国外支原体的培养分离培养基包括商品化的Difc〇、〇x〇id等 公司干燥基础基，法国生物梅里埃的成品培养基，均占有中国相当大的市场。法国生物梅里 埃公司甚至把研发中心及一些大宗产品生产基地建在上海浦东高科技开发区。液体培养常 用试管、青霉素安培瓶进行培养，固体培养惯用圆形培养皿等，还有双相培养基，市场上产 品五花八门，真假难分，但是均对习湿需〇) 2的支原体的培养、鉴别及药敏测定存在各种各 样、不如人意的问题。
[0007] 目前Uu、Mh的单一培养基只能供一种支原体生长，在37°C-38°c温箱培养2-4天， 观察、出结果。通常以培养基变色判断生长与否，有的阳性率低，有的是假阳性高。
[0008] 解脲脲原体（Uu)是脲原体属中的一个种，因生长需要尿素而得名。菌落微小，直 径仅有15~25um，须在40~100倍显微镜下观察，故旧称T株。菌落表面有粗糙颗粒，在 合适条件下可转成典型的荷包蛋样菌落。生长需要胆固醇和尿素，分解尿素为其代谢特征， 产生氨氮，使培养基pH上升，患者小便往往带有臊腥味。在培养基中加入尿素并以硫酸锰 (菌落呈棕色）作指示剂极易与Mh等支原体作出鉴别。
[0009] 人型支原体（Mh)可在鸡胚绒毛尿囊膜上或细胞培养中生长。用培养基培养时，营 养要求比细菌高。由于它没有细胞壁，因此对青霉素等不敏感，但对四环素、卡那霉素、链霉 素、氯霉素等作用于核蛋白体的抗生素等有杀伤作用，Mh对林可霉素敏感而对红霉素耐药， Uu则相反；支原体对热抵抗力差，通常55°C经15分钟处理即灭活。石碳酸、来苏儿易将其 杀死。
[0010] 泌尿生殖道感染Uu和/或Mh后，可出现尿道炎症状，男性可继发慢性前列腺炎， 在检查前列腺液时，可见活泼、泳动的微生物群体。支原体还继续感染精道、精囊和睾丸，影 响精子和精液的质量；主要通过性生活传播，初期患者大多无明显症状，后期可引起生殖系 统炎症，是不孕不育的重要原因。女性的泌尿生殖道的带菌、发病情况更严重。
[0011] 我国对支原体基础及医院实验诊断的研宄起步晚，多模仿国外方法，存在着临床 培养阳性率低、易污染杂菌、出现假阳性等诸多问题，不能满足临床诊断治疗的需求；而且 国内各实验室用于支原体的分离培养基，多数进口，价格昂贵；有的自制，质量不稳定，卫生 管理部门已立法管理，促进研发创新产品。
[0012] 常规的支原体诊断方法与技术如下：
[0013] (1)基因诊断方法的建立：核酸杂交、PCR及连接酶链反应（LCR)具有快速、敏感、 特异性高等优点，已成功用于支原体的检测，但操作不当可出现假阳性或假阴性结果。
[0014] (2)重组支原体抗原诊断：近年来将支原体种特异性和多型高度保守的表位编码 基因重组以制备重组抗原，制备mAb，采用标记技术用于临床诊断，以ELISA快速测定支原 体抗原较为普遍；放射核素标记因有辐射危害，已逐渐被非放射性标记物所替代。此外，支 原体检验中微量化与自动化也是诊断的发展方向。
[0015] (3)培养检测：临床微生物培养，可见活菌、菌落，是最直接的方法，即谓"金标 准"，临床20~48h即可出报告。目前方法不够完善。
[0016] 目前，商业产品及文献中介绍的常用的支原体培养基如下：
[0017] 最常用的基础培养基--Hayflick培养基（PPLO培养基），牛心粉50g、蛋白胨 l〇g、氯化钠5g、加14g琼脂粉为固体培养基。根据、Uu、Mh的需要，配制如下的培养基：
[0018] 解脲支原体培养基：基础培养基70ml、马血清20ml、25%的酵母浸液10ml、30%尿 素 0? 33ml、0. 4%酚红 0? 5ml、制霉素 0? 001g、青霉素 10 万IU，pH6. 0。
[0019] 人型支原体培养基：基础培养基7〇1111、马血清2〇1111、25%的酵母浸液1〇1111、30% L一精氨酸 〇? 33ml、0. 4%酚红 0? 5ml、制霉素 0? 001g、青霉素 10 万IU，pH6. 3。
[0020] 由于解脲支原体培养基与人型支原体培养基的生长环境不同，并且生长所需要的 成分不同，因此，现在还没有能够同时进行解脲支原体与人型支原体同时培养的培养基。
【发明内容】
[0021] 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种成分较为简单、 能够同时进行Uu与Mh培养的泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基及其应用。
[0022] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0023] -种泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基，每1000ml培养基含有以下成分：
[0024]
【主权项】
1. 一种泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基，其特征在于，每1000ml培养基含有以下 成分：
添加剂：DMEM50-150ml，自制生物因子5-15ml; 纯水加入定容至l〇〇〇ml。
2. 根据权利要求1所述的一种泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基，其特征在于，每 1000ml培养基还含有以下抑菌剂：氨苄青霉素1百万单位，纳他霉素50mg。
3. 根据权利要求1所述的一种泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基，其特征在于，每 1000ml培养基还含有以下成分：
添加剂：DMEM100ml、自制生物因子10ml、氨苄青霉素1百万单位、纳他霉素50mg; 纯水加入定容至l〇〇〇ml。
4. 根据权利要求1~3中任一所述的一种泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基，其特 征在于，所述的自制生物因子为禽蛋黄提取物，所述的禽蛋黄提取物中含有维生素A及有 机硒，所述的维生素A含量为2~10u/ml，所述的有机硒含量为0. 2~2.Oppm。
5. 根据权利要求4所述的一种泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基，其特征在于，所 述的禽蛋黄提取物还含有微量的不饱和脂肪酸类与磷脂类物质，以及l〇-25v/v%的乙醇。
6. 根据权利要求4或5所述的一种泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基，其特征在于， 所述的禽蛋黄提取物制备方法如下： (1) 取新鲜富硒鸡蛋置入70v/v%乙醇溶液中浸泡30分钟； (2) 在超净工作台上无菌操作取蛋黄，将蛋黄置于无菌烧瓶中； (3) 向含有蛋黄的无菌烧瓶中以1 :2重量比例，加入90v/v%乙醇，充分搅拌、混匀，封 闭瓶口后置于4°C~8°C下，保存20-24h; (4)用INNaoH调节步骤（3)处理后溶液的pH至7. 0~8. 0,并6000RPM离心，取上清 液，将上清液以0. 45ym滤膜无菌过滤后，滤液即为禽蛋黄提取物，将滤液无菌分装后，备 用。
7. 根据权利要求1~3中任一所述的一种泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基，其特 征在于，所述的培养基通过稀酸稀碱调节酸碱度，使培养基pH为5. 8-6. 2。
8. 根据权利要求7所述的一种泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基，其特征在于，所 述的培养基通过稀酸稀碱调节酸碱度，使培养基pH为6. 0-6. 2。
9. 根据权利要求1~3中任一所述的一种泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基，其特 征在于，所述的培养基在4°C-10°C下保存。
10. -种如权利要求1~3中任一所述的泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基的应 用，其特征在于，Uu和/或Mh的标本和/或新鲜培养物菌浓度达到104-106ccu/ml时，以 l-5wt%的比例接种入培养基中，37°C~38°C温箱培养，18-22h后观测Uu培养情况，28-36h 后观测Mh培养情况。
【专利摘要】本发明涉及一种泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基及其应用，每1000ml培养基含有以下成分：蛋白胨15g、胰胨15g、氯化钠5g、尿素5g、精氨酸5g、0.4％酚红10ml、牛血清50ml、DMEM 50-150ml、自制生物因子5-15ml，纯水加入定容至1000ml。与现有技术相比，本发明的培养基由于添加剂的加入，提高了培养基的性能及选择性，营养成分更丰富，容易满足Uu及Mh的生长繁殖要求，一般情况下，比传统培养基提早一天观察、报告结果。
【IPC分类】C12N1-20, C12R1-35
【公开号】CN104694425
【申请号】CN201510075106
【发明人】文凤岐, 石楠, 武济民, 孙亚洲, 肖家祁
【申请人】众爱生河北生物科技有限公司
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年2月12日