快速鉴定南瓜实蝇的ss-pcr特异性引物及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检疫性害虫检测领域，快速鉴定南瓜实蝇的SS-PCR特异性引物及试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 南瓜实幡Bactrocera(Zeugodacus)tau(Walker)是一种入侵重大检疫性害虫，属 双翅目Diptera实幡科Tephritidae果实幡属Bactrocera果实幡亚属Bactrocera。南瓜 实蝇是农业上的重要害虫，现今在日本、越南、老挝、柬埔寨、泰国、马来西亚、菲律宾、印度 尼西亚、不丹、印度、斯里兰卡以及中国等国家均有分布。在进出境的果蔬中经常截获各种 不同的实蝇的幼虫、卵或蛹，甚至为头、胸、翅、足等残体，对于幼虫的分类鉴定要比成虫要 困难得多，为了保证鉴定的准确性通常是将幼虫在室内饲养为成虫，而这需要花费较长的 时间，严重影响了水果进出口贸易的通关速度；而对于残体则是无法对其进行正确的识别。
[0003] 近年来，以研宄基因结构和功能为主的现代分子生物学和以DNA重组技术为核心 的生物技术研宄取得了突飞猛进的发展，预示着分子生物技术将成为21世纪的新兴重点 学科。分子生物学技术主要针对于形态特征极其相似的近缘种、复合种及种以下的亚种、生 物型、地理种群的识别和鉴定，能解决传统的形态学分类方法难以解决的问题。因此，迫切 需要发展有关于实蝇的快速鉴定识别的技术。
[0004] 种特异引物PCR(Species-specificPCR，SS-PCR)技术是与通用引物 PCR(universal-primersPCR，UR-PCR)技术相区别而提出来的，两种技术的原理相似，只是 种特异引物PCR技术在根据靶序列设计引物时，要充分考虑引物的特异性，能够在扩增未 知模版时，通过检测目标片段的有无就能把目标种和其它种鉴别开来。
[0005] 对于卵或头、胸、翅、足等残体的检测，样本中仅存微粒靶标DNA，因此，需要设计的 种特异引物具有极高的灵敏性；同时，样本中可能混有近源物种，因此要求设计的种特异引 物具有加强的特异性。现有技术虽然提供了根据已知序列设计扩增引物的软件，但不能解 决如何兼具灵敏性和特异性的问题。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供快速鉴定南瓜实蝇的SS-PCR特异性引物。
[0007] 本发明的再一目的是提供快速鉴定南瓜实蝇的试剂盒。
[0008] 本发明的再一目的是提供快速鉴定南瓜实蝇的方法。
[0009] 根据本发明的快速鉴定南瓜实蝇的SS-PCR特异性引物包括：
[0010] NF404 :5'TGCCTTAGCGATATTCTGGCT3' ；
[0011] NR610 :5'AACTGTGTTCAGCAGGTGGT3'。
[0012] 上述引物对扩增得到的鉴定南瓜实蝇的特异性片段的序列为：
[0013] 5 '-AGGATGAACAGTTTACCCACCCCTATCGTCTATTATTGCTCATGGAGGAGCATCAGTTGATTTAGC AATTTTTTCTTTACACCTAGCAGGAATCTCATCTATTTTAGGGGCTGTAAATTTTATTACTACAGTCATTAATATAC GATCAACAGGAATTACTTTCGATCGAATACCTTTATTTGTTTGAGCCGTTGTATTAACTGCCCTCCTTTTATTACTT TC-3'
[0014] 本发明提供了一种采用特异性引物快速鉴定南瓜实蝇的方法，能够准确及时对截 获的疑似南瓜实蝇的卵、蛹、幼虫、成虫及残体等进行鉴定，建立了一种快速鉴定南瓜实蝇 的方法。
[0015] 根据本发明的【具体实施方式】，通过种特异引物PCR(SS-PCR)和琼脂糖凝胶电泳技 术，筛选出了 1对南瓜实蝇的特异性引物，引物序列为：NF404:TGCCTTAGCGATATTCTGGCT; NR610 :AACTGTGTTCAGCAGGTGGT。选用番石榴实蝇、桔小实蝇、颜带实蝇、锈实蝇、瘤胫实蝇、 杨桃实蝇、瓜实蝇、辣椒实蝇、具条实蝇、近黑颜实蝇、黑膝实蝇、滇寡鬃实蝇、何氏华实蝇、 枣实蝇、瓜棍腹实蝇、腿端黑实蝇、黑颜实蝇等作为阴性对照来证明本发明设计的引物的特 异性，大大缩短了南瓜实蝇的鉴定周期。
[0016] 本发明具体提供了一种采用特异性引物快速鉴定南瓜实蝇的方法，具体方法如 下：
[0017] (1)通过种特异引物PCR(SS-PCR)和琼脂糖凝胶电泳技术，筛选出了 1对南 瓜实蝇的特异性引物NF404和NR610。SS-PCR在定量梯度PCR仪上进行，反应体系： 2XEasyTaqPCRSuperMix12.5uL，引物各luL，模板各 2uL，加ddH20 至总体积 25uL; 反应条件为 94°C/5min，94°C/40s，62°C/30s，72°C/lmin，30 个循环，最后延伸 7min; 分别提取5uLPCR产物在含DNA染色剂的1.5 %的琼脂糖凝胶多功能电泳仪上电泳 30min(120V)，利用凝胶成像分析仪检测是否扩增出预期大小的目标片段，拍摄并记录结 果。最终获得一对特异性引物NF404和NR610,该对引物可以快速、准确、特异性地检测出 南瓜实蝇的各个虫态甚至残体，引物序列为：NF404 :5'TGCCTTAGCGATATTCTGGCT3' ；NR610 : 5'AACTGTGTTCAGCAGGTGGT3'。
[0018] (2)采用SS-PCR引物的种特异性的检验：选用番石榴实蝇、桔小实蝇、颜带实蝇、 锈实蝇、瘤胫实蝇、杨桃实蝇、瓜实蝇、辣椒实蝇、具条实蝇、近黑颜实蝇、黑膝实蝇、滇寡鬃 实蝇、何氏华实蝇、枣实蝇、瓜棍腹实蝇、腿端黑实蝇、黑颜实蝇作为阴性对照，南瓜实蝇为 阳性对照，验证南瓜实蝇特异性引物的种特异性。结果表明，仅南瓜实蝇在207bp处有一条 特异性扩增的条带，阴性对照均无特异性目标片段，从而证明该引物在实验涉及的这些实 蝇种类范围内，能特异性的鉴定南瓜实蝇。
[0019] 一方面，引物的特异性是本实验成功的关键，特异性片段要有足够变异能够将不 同物种区分开。另一方面，当口岸仅发现卵或是残体时，即只能提取到微量DNA时，SS-PCR 检测鉴定方法的灵敏度就至关重要了。根据本发明的技术方案具有较高的灵敏度，能检测 到的DNA模板浓度可低至57. 41X1(T2,同时该SS-PCR特异性引物能够稳定区分近似物种， 因此，本发明的检测鉴定方法在实际检疫工作中也得到应用和验证。
[0020] 综上所述，本发明所建立的SS-PCR快速鉴定南瓜实蝇的方法具有快速简便、特异 性尚、灵敏度尚等优点，可以在8小时之内完成南瓜实幡的鉴定，能够满足口岸检验检疫快 速通关的要求。
【附图说明】
[0021] 图1显示引物NF404和NR610的种特异性验证，M:100bpDNALadder，1 :南瓜实 幡B.tau，2 :番石植实幡B.correcta，3 :桔小实幡B.dorsalis，4 :颜带实幡B.cilifer， 5 :南瓜实幡B.rubigina，6:瘤腔实幡B.tuberculata，7 :杨桃实幡B.carambolae，8:瓜实 幡B.cucurbitae，9 :辣椒实幡B.latifrons，10 :具条实幡B.scutellata，11 :近黑颜实幡 B.parater，12 :黑膝实幡B.scutellaris，13 :何氏华实幡B.hochii，14 :赛实幡Carpomya vesuviana，15 :瓜棍腹实幡Dacuslongicornis，16 :腿端黑实幡B.atrifemur，17 :黑颜实 幡B.diaphora，18 :空白对照ddH20 ;
[0022] 图2显示SS-PCR快速鉴定南瓜实蝇的应用与验证，M:100bpDNALadder，1-17 : 南瓜实幡B.tau，18 :具条实幡B.scutellata，19 :瓜实幡B.cucurbitae，20 :空白对照dd H20;
[0023]图 3 显示引物NF404 和NR610 的灵敏度验证，（M:100bpDNALadder，1 :10°，2: 10'3 :1〇-2,4 :1〇-3,5 :空白对照ddH20。
【具体实施方式】[0024] 实施例1
[0025] 具体的，本发明进一步提供了一种采用特异性引物快速鉴定南瓜实蝇的方法，其 具体步骤如下：
[0026] 采用试剂盒法提取南瓜实蝇基因组DNA。通过筛选获得能特异性鉴定南瓜实蝇的 一对特异性引物，即NF404和NR610,特异性引物序列分别为：
[0027] NF404:5'TGCCTTAGCGATATTCTGGCT3' ；
[0028]NR610 :5'AACTGTGTTCAGCAGGTGGT3' ；
[0029] 利用核酸蛋白检测仪测定DNA浓度检测。
[0030] 一、SS-PCR引物的种特异性验证：
[0031] 选用番石榴实蝇、桔小实蝇、颜带实蝇、锈实蝇、瘤胫实蝇、杨桃实蝇、瓜实蝇、辣椒 实蝇、具条实蝇、近黑颜实蝇、黑膝实蝇、滇寡鬃实蝇、何氏华实蝇、枣实蝇、瓜棍腹实蝇、腿 端黑实蝇、黑颜实蝇作为阴性对照，南瓜实蝇为阳性对照，验证南瓜实蝇特异性引物的种特 异性。SS-PCR在定量梯度PCR仪上进行，反应体系：2XEasyTaqPCRSuperMix12.5uL， 引物各luL，模板各2uL，加ddH20至总体积25uL;反应条件为94°C/5min，94°C/40s， 62°C/30s，72°C/lmin，30个循环，最后延伸7min;分别提取5uLPCR产物在含DNA染色剂的 1. 5%的琼脂糖凝胶多功能电泳仪上电泳30min(120V)，利用凝胶成像分析仪检测是否扩增 出预期大小的目标片段，拍摄并记录结果。
[0032] 结果如图1所示，仅南瓜实蝇在207bp处有一条特异性扩增的条带，阴性对照均无 特异性目标片段，从而证明该引物在实验涉及的这些实蝇种类范围内，能特异性的鉴定南 瓜实蝇。
[0033] 二、SS-PCR引物对不同虫态的扩增效果以及灵敏度检测：
[0034] 分别以提取南瓜实蝇的卵、幼虫、蛹和成虫的DNA为模版，进行靶标片段扩增效果 检验。任取南瓜实蝇DNA模板，测的其浓度为57. 41ng/ul，按10_\ 10_2、10_3倍梯度稀释，然 后使用种特异性引物NF404和NR610进行PCR扩增，进行最低检出阈值的测定，SS-PCR方 法的检测限度达57. 41X1(T2,最适模版DNA浓度为57. 41XKT1。如图2、图3所示，所筛选 的SS-PCR扩增引物的准确性高，具有极佳的灵敏度。
【主权项】
1. 快速鉴定南瓜实蝇的SS-PCR特异性引物对，其特征在于包括： 引物NF404 :5'TGCCTTAGCGATAITCTGGCT3' ；和 引物NR610 :5'AACTGTGTTCAGCAGGTGGT3'。
2. 用于南瓜实蝇的快速鉴定的特异性基因片段，其特征在于，所述基因片段的核苷酸 序列如SEQIDNo:3所示。
3. -种南瓜实蝇特异性检测方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述 SS-PCR引物对进行PCR扩增的步骤。
4. 一种南瓜实蝇检测特异性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所 述的南瓜实蝇特异性SS-PCR引物对。
【专利摘要】本发明涉及检疫性害虫检测领域，快速鉴定南瓜实蝇的SS-PCR特异性引物对及试剂盒，包括引物NF404：TGCCTTAGCGATATTCTGGCT；和引物NR610：AACTGTGTTCAGCAGGTGGT。本发明所建立的SS-PCR快速鉴定南瓜实蝇的方法具有快速简便、特异性高、灵敏度高等优点，可以在8小时之内完成南瓜实蝇的鉴定，能够满足口岸检验检疫快速通关的要求。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104711364
【申请号】CN201510149999
【发明人】郭琼霞, 黄振, 娄定风, 林阳武, 沈建国, 陈韶萍
【申请人】福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年4月1日