交替假单胞菌属细菌mb117及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及交替假单胞菌属(Pseudoalteromonassp.)的新细菌以及该菌株的应用。
技术背景
[0002]纤维素是植物细胞壁的主要成分，是葡萄糖以β_1，4糖苷键结合的聚合物，占植物界碳含量的50%以上。纤维素类物质同时也是地球上最丰富的可再生资源，如农村大量的农作物秸杆、工农业生产过程中的纤维性废渣等，这些物质目前还未得到充分的开发和利用，造成了资源的巨大浪费。纤维素的利用与转化对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义。为了更好的利用纤维素，国内外越来越多的学者开始关注纤维素酶，期望能够通过纤维素酶将地球上最丰富、最廉价的可再生资源转化为高效的、可直接利用的能源和资源。
[0003]纤维素酶是一类能将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，它们协同作用，分解纤维素产生寡糖和纤维二糖，最终水解为葡萄糖，在能源、食品、医药、造纸、纺织、工业洗涤、烟草、石油开采、废水处理等众多领域中有十分广泛的应用价值。一般一个纤维素酶中有十几到几十个组分，根据功能不同分三类:①内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4):也称Cx酶、CMCase，来自于真菌简称EG，来自于细菌简称Len。作用于非结晶区，随机水解β_1，4-糖苷键，产生带有非还原末端的小分子纤维素，分子量约23-146kDa。②外切葡聚糖酶(EC3.2.1.91):也称Cl酶、纤维二糖水解酶，来自于真菌简称CBH，来自于细菌简称Cex。作用于纤维素线状分子末端，水解β_1，4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子。是酶系中重要组分，在天然纤维素降解中起主导作用，分子量约38-118kDa。③β -葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21):水解纤维二糖及短链的纤维寡糖生成葡萄糖，分子量约76kDa。纤维素酶的来源主要有三个方面:动物、植物和微生物，其中利用微生物发酵是大规模制备纤维素酶的最有效的途径。
[0004]目前用来生产纤维素酶的微生物主要是丝状真菌，如木霉、曲霉、根霉、青霉等，而细菌纤维素酶由于对天然纤维素的水解作用较弱，长期以来没有受到足够的重视，对其研宄相对较少。但由于细菌纤维素酶一般为中性或碱性，近年来随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，以及耐热性纤维素酶在燃料酒精生产中的应用，细菌纤维素酶制剂已显示出良好的应用性能和巨大的经济价值。同时，细菌作为原核微生物，其基因一般不含内含子，可直接从基因组DNA中克隆到目的基因用于工程菌的构建，这也是细菌纤维素酶优于真菌纤维素酶的一个非常重要的方面。因此，近年来对细菌纤维素酶的研宄开始逐年升温。海洋微生物酶具有耐碱、耐盐、耐冷以及最适PH和反应温度适中，随反应温度的降低酶活性下降缓慢等特点，有着不同于陆源微生物酶的独特应用前景。因此，筛选和研宄生产纤维素酶的海洋细菌就具有更为重要的意义。
【发明内容】
[0005]为此，本发明第一方面提供了一种交替假单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.)细菌 MB117。
[0006]本发明第二方面提供了一种纤维素酶液，其中所述的纤维素酶液是利用细菌MB117发酵制备。
[0007]本发明第三方面提供了一种制备纤维素酶液的方法，其包括以下步骤:
[0008](a)从MB117斜面上取一环菌接种至2216E液体培养基中，于28°C，150r/min培养24小时，制成种子液；
[0009](b)将种子液接种于液体发酵培养基中进行发酵培养；
[0010](c)将培养结束的菌悬液在4°C下，5000r/min离心10分钟，上清液即为粗酶液。
[0011]根据本发明第三方面的方法，其中步骤(b)中，所述的液体发酵培养基为在2216E液体培养基中添加羧甲基纤维素钠后的液体培养基。
[0012]根据本发明第三方面的方法，其中步骤(b)中，所述的液体发酵培养基的初始pH值为5?10。
[0013]根据本发明第三方面的方法，其中步骤(b)中，所述的液体发酵培养基的装液量为 10%?30%。
[0014]根据本发明第三方面的方法，其中步骤(b)中，所述种子液接种量为0.5%?1.
[0015]根据本发明第三方面的方法，其中步骤(b)中，所述发酵培养的时间为24?60小时。
【附图说明】
[0016]图1为发酵时间对菌株生长和产酶的影响关系图
[0017]图2为接种量对菌株生长和产酶的影响关系图
[0018]图3为培养基初始pH对菌株生长和产酶的影响关系图
[0019]图4为装液量对菌株生长和产酶的影响关系图
[0020]图5为培养温度对菌株生长和产酶的影响关系图
【具体实施方式】
[0021]下面结合实施例对本发明进行详细的描述
[0022]一、发酵时间对菌株生长和产酶的影响
[0023]将种子液接种于250ml三角瓶盛装的50ml液体发酵培养基中，28°C，150r/min培养，每隔12小时取样测生物量和纤维素酶活力。如图1所示，MB117培养24小时后，达到最大的生物量和CMCase产量，其中CMCase为17.67U，因此，MB117的培养时间以24小时为宜。同时，CMCase在培养后的24?60小时内表现出良好的稳定性，培养后60小时为24小时的81%。
[0024]二、接种量对菌株生长和产酶的影响
[0025]取培养24小时的种子液，分别按0.5%，1%，1/5%和2%的接种量接种于250ml三角瓶盛装的50ml液体发酵培养基中，28°C培养24小时后测生物量和酶活力。如图2所示，接种量虽然对生物量的影响不大，但对酶活力的影响较大。接种量为0.5%和1%时，酶活较强，而接种量增大则不利于产酶。综合生物量的结果，以1%接种量最佳。
[0026]三、培养基初始pH对菌株生长和产酶的影响
[0027]将液体发酵培养基的pH分别调至3、4、5、6、7、8、9、10、11和12，取培养24小时的种子液，按1%的接种量接种于250ml三角瓶盛装的50ml培养基中，28°C培养24小时后测生物量和酶活力。如图3所示，过酸和过碱的环境均不利于MB117的生长和产酶。在pH为5?10的范围内，MB117生长和产酶较稳定，其中以pH为7时最佳。
[0028]四、装液量对菌株生长和产酶的影响
[0029]250ml三角瓶中分别盛装25ml、50ml、75ml和10ml液体发酵培养基，即装液量分别为10%、20%、30%和40%，然后按1%的接种量进行接种，28°C培养24小时。如图4所示，20%和30%的装液量最利于菌体生长，而10%的装液量最利于产酶。10%装液量时CMCase为25.30U，20%装液量时CMCase为18.37U，为10%装液量时酶活的73%。
[0030]五、培养温度对菌株生长和产酶的影响
[0031]分别考察了 20°〇、25°〇、30°〇、35°〇和40°〇培养时]\^117的生长和产酶情况，结果如图5所示。低温有助于菌体生长和产酶，20 °C时CMCase为36.01U，25°C时CMCase为26.16U，30°C时CMCase为16.20U，40°C时菌体停止了生长和产酶。这与MBl 17来源于海洋环境有关，海洋微生物长期适应了海洋的低温环境，高温不利于其生长和产酶。
【主权项】
1.一种交替假单胞菌属细菌MB117。
2.—种纤维素酶液，其利用权利要求1所述的细菌MB117发酵制备。
3.制备权利要求2所述纤维素酶液的方法，其包括以下步骤: (a)从MBl17斜面上取菌接种至2216E液体培养基中，于28°C，150r/min培养24小时，制成种子液； (b)将种子液接种于液体发酵培养基中进行发酵培养； (c)将培养结束的菌悬液在4°C下，5000r/min离心10分钟，上清液即为粗酶液。
4.根据权利要求3的方法，其中步骤(b)中，所述的液体发酵培养基为在2216E液体培养基中添加羧甲基纤维素钠后的液体培养基。
5.根据权利要求3的方法，其中步骤(b)中，所述的液体发酵培养基的初始pH值为5?10。
6.根据权利要求3的方法，其中步骤(b)中，所述的液体发酵培养基的装液量为10%?30%。
7.根据权利要求3的方法，其中步骤(b)中，所述种子液接种量为0.5%?1.5%。
8.根据权利要求3的方法，其中步骤(b)中，所述发酵培养的时间为24?60小时。
【专利摘要】本发明公开了一种交替假单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.)的海洋细菌MB117，本发明的海洋细菌MB117具有产生碱性纤维素酶的能力。
【IPC分类】C12N9-42, C12N1-20, C12R1-01
【公开号】CN104745516
【申请号】CN201510167558
【发明人】曲均革
【申请人】浙江医药高等专科学校
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年4月1日