一种用生物技术生产中药材原料喜树碱的方法
【技术领域】
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[0001]本发明涉及生物技术领域，是一种将双关键酶基因通过发根农杆菌介导转化喜树，从而提高毛状根喜树碱产量的方法。
【背景技术】
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[0002]喜树碱是喜树中提取出来的一种具有显著抗肿瘤活性的生物碱，已有多种喜树碱类药物如依立替康和拓扑替康获得美国FDA认证，在临床上被广泛用于治疗卵巢癌、直肠癌及白血病等多种恶性肿瘤，市场需求十分巨大。目前世界上喜树碱类药物的生产主要是从喜树等植株中提取，然而由于喜树天然资源数量有限，生长十分缓慢，喜树碱及其类似物在植物体内含量又非常低，且提取环节多、费时费力，所以从天然喜树中提取喜树碱的方法已远远不能满足人们对喜树碱日益增长的需求。
[0003]多年来，国内外学者围绕着扩大喜树碱药源问题进行了诸多领域的研究如化学全合成，半合成及细胞培养等，取得了一定的进展。喜树碱的化学全合成虽然已经成功，但因成本太高、产量太低、周期太长且易造成环境污染等因素而限制了其商业化生产；半合成方法虽然是目前最有效的途径之一，但其前体的提取分离仍然依赖于天然资源的供应；细胞悬浮培养则存在喜树碱产量低及稳定性较差等问题同样难以实现工业化生产。相比之下，利用基因工程技术将喜树碱生物合成途径中的关键酶基因导入喜树中，继而获得转基因的发根系，并进行大规模的培养是提高喜树碱产量的最佳途径之一。
[0004]喜树碱的生物合成来自于萜类吲哚生物碱。由莽草酸途径的色胺与由5-磷酸脱氧木酮糖途径生成的裂环马钱子苷，在异胡豆苷合成酶(STR)催化下形成吲哚生物碱的共同前体异胡豆苷，再经几步酶促反应后最终生成喜树碱和羟基喜树碱。大量研究表明，异胡豆苷合成酶(STR)，香叶醇-10-脱氢酶(GlOH)，色氨酸脱羧酶(TDC)及1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)等关键酶在喜树碱的生物合成中具有重要作用。
[0005]我们利用已克隆的长春花CrSTR和CrGlOH基因，构建植物双价表达载体，以发根农杆菌C58C1为介导，将异胡豆苷合成酶CrSTR和香叶醇_10_脱氢酶CrGlOH基因同时导入喜树下胚轴组织并再生出毛状根。通过高效液相色谱法测定喜树转基因毛状根中喜树碱含量，筛选出喜树碱含量显著提高的喜树转基因毛状根株系。
[0006]我公司采用基因工程手段，将喜树碱合成过程中的两个关键酶基因CrSTR和CrGlOH共转化喜树,打破了喜树碱生物合成途径的瓶颈效应,获得喜树碱高产的喜树毛状根或植株，为生产喜树碱和羟基喜树碱提供了新型优质药源。
【发明内容】
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[0007]本发明包括如下步骤:
[0008](I)以CrSTR和CrGlOH基因的cDNA序列设计引物，以长春花幼苗RNA为模板PCR获得CrSTR和CrGlOH基因片段；将CrSTR和CrGlOH基因插入植物表达载体pCAMBIA1304
质粒，构建重组载体；
[0009](2)将获得的重组载体转入发根农杆菌C58C1，构建含有重组载体的发根农杆菌；
[0010](3)利用所构建的含有重组载体的发根农杆菌转化喜树下胚轴，获得毛状根；
[0011](4)检测毛状根中的异胡豆苷合成酶基因CrSTR和香叶醇-10-脱氢酶基因CrGlOH，取筛选结果为阳性的转基因毛状根克隆；
[0012](5)用高效液相色谱法测定喜树转基因毛状根中喜树碱含量,进一步筛选喜树碱含量显著提高的喜树转基因毛状根株系。
【具体实施方式】
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[0013]下面结合具体实施例详细阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆建议的条件。
[0014]实施例1
[0015]长春花CrSTR及CrGlOH基因片段的获得
[0016]1.1长春花总RNA的提取及cDNA第一链的合成
[0017]使用TIANGEN公司提供的RNA提取试剂盒从长春花幼苗中提取总RNA (提取步骤参照试剂盒内的说明书)。用于提取总RNA的长春花幼苗的鲜重量为0.1g左右，提取的RNA在分光光度计上测定相关的吸光值，计算所提取RNA的纯度及浓度。根据不同RNA样品的浓度，分别以0.5ug RNA为起始量，用反转录酶进行第一链cDNA的合成(操作步骤参照Promega公司提供的相关说明书)。
[0018]1.2CrSTR和CrGlOH基因片段的获得
[0019]根据CrSTR和CrGlOH基因的编码序列，分别设计扩增出完整的上下游特异引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点，以便构建植物表达载体。以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。
[0020]实施例2
[0021]含长春花CrSTR及CrGlOH基因的植物表达载体的构建
[0022]2.1中间载体pCAMBIA1304的构建
[0023]以pBI121和pCAMBIA1304为材料，构建植物表达载体pCAMBIA1304。具体地，Hindlll/EcoRl 双酶切 pBI 121 和 pCAMBIA1304 ;回收 pBI 121-GUS 表达盒及 pCAMBIA1304大片段；连接转化，挑取单克隆菌落抽提质粒酶切验证。
[0024]2.2植物表达载体pCAMBIA1304-CrG10H的构建
[0025]用从长春花中克隆的CrGlOH基因替换中间载体pCAMBIA1304的⑶S基因。具体地，BamHI/SacI 双酶切 pMD18T_CrG10H 和 pCAMBIA1304 ;回收 CrGlOH 基因和 pCAMBIA1304大片段；连接转化，挑取单克隆菌落PCR筛选阳性克隆。
[0026]2.3 植物表达载体 pCAMBIA1304-CrSTR-CrG10H 的构建
[0027]用从长春花中克隆的CrSTR基因替换pCAMBIA1304_CrG10H上的GFP+GUS基因。具体地，Bglll/BstEII 双酶切 pMD18T-CrSTR 和 pCAMBIA1304— CrGlOH，回收 CrSTR 基因及pCAMBIA1304-CrG10H大片段；连接转化，挑取单克隆菌落PCR筛选阳性克隆。
[0028]实施例3
[0029]发根农杆菌C58C1介导CrSTR和CrGlOH基因转化喜树
[0030]3.1发根农杆菌工程菌的获得
[0031]将含CrSTR和CrGlOH基因的植物双价表达载体pCAMIA1304_CrSTR-CrG10H转入发根农杆菌C58C1中，挑取单克隆菌落进行PCR验证。
[0032]3.2外植体的预培养
[0033]剪取喜树无菌3cm长下胚轴，接种到预培养培养基B5上，25°C暗培养2d。
[0034]3.3发根农杆菌与外植体的共培养
[0035]将上述预培养的喜树下胚轴外植体，放入含活化好的发根农杆菌工程菌的1/2MS悬液中浸泡10分钟后，用无菌吸水纸吸干表面菌液，转到共培养培养基B5中，暗培养2d。
[0036]3.4毛状根的诱导和继代培养
[0037]将上述外植体转接到固体培养基(B5+Cef500mg/1)中，25°C光照培养2_3周，可从外植体伤口处长出毛状根。剪下3cm长毛状根，接种于B5+Cef500mg/1培养基中暗培养3周。转入B5+Cef250mg/1培养基中继代筛选，每2周继代培养一次。经过数次继代后，将生长良好的喜树毛状根转入无抗生素的B5培养基上继续暗培养20d左右。
[0038]实施例4
[0039]利用高效液相法测定转基因喜树毛状根喜树碱含量
[0040]4.1色谱条件及标准曲线的制作
[0041]高效液相色谱条件:色谱柱Alltech Econosi C18不锈钢柱，流动相为乙腈:水(35: 65)，检测波长254nm，柱温30°C，流速lml/min，进样量20ul。分别精密称取2mg喜树碱和羟基喜树碱标准品，置于50ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得浓度为40ug/ml的标准品液。
[0042]分别取5ul, 1ul, 15ul, 20ul, 30ul标准品液在相应色谱条件下进样,记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品浓度(X，ug/ml)进行回归分析。结果表明，喜树碱和轻基喜树碱在2.5-25mg/l范围内呈现良好的线性关系。喜树碱和轻基喜树碱标准品的峰面积(Y)对浓度(X)的线性回归方程为=Y = 1556.26X—1107.64，r = 0.9997。
[0043]4.2毛状根液体培养
[0044]选择生长快的毛状根，在超净工作台上剪取3cm，用蒸馏水冲洗后接入200ml B5液体培养基中100rpm，25°C暗培养。每20天更换一次新鲜B5液体培养基，80天后收获。取适量新鲜毛状根用吸水纸吸干表面水分，烘干。
[0045]4.3转基因毛状根喜树碱含量的提取及测定
[0046]将烘干的转基因喜树毛状根放入研钵中充分研磨，取10mg毛状根干粉加入甲醇10ml，超声30min，5(TC放置过夜，次日拿出离心(12000rpm，1min)，吸取上清萃取液后，再加入甲醇1ml,超声30min,离心(12000rpm, 1min),收集两次的上清萃取液减压蒸发,残余物重新用Iml甲醇溶解，样品用0.22um滤膜过滤后取20ul，注入高效液相色谱仪，记录各组分峰面积，代入线性回归方程，计算即得样品喜树碱和羟基喜树碱含量。
[0047]本发明利用现代基因工程技术将喜树碱合成途径中的两个关键酶基因CrSTR和CrGlOH导入表达载体，并介导到喜树中，获得转基因的毛发根，再筛选高表达株系进行培养。这就大大提高了喜树中喜树碱的含量,为规模化生产奠定了基础,也为解决喜树碱药源紧缺提供了一条较佳途径。对于解决卵巢癌、直肠癌及白血病等恶性肿瘤病人痛苦，保障人们的健康水平，具有重大意义。
【主权项】
1.一种利用基因工程技术提高喜树碱产量的方法，其特征在于包括如下步骤: (I)将异胡豆苷合成酶基因CrSTR和香叶醇-10-脱氢酶基因CrGlOH插入植物表达载体，构建重组载体后，转入发根农杆菌，构建含有重组载体的发根农杆菌；(2)利用发根农杆菌菌株转化喜树，获得毛状根，并进行培养；(3)检测毛状根中的异胡豆苷合成酶基因CrSTR和香叶醇-10-脱氢酶基因CrGlOH，取筛选结果为阳性的转基因毛状根克隆。
2.根据权利要求1所述提高喜树碱产量的方法其特征在于所用植物表达载体为PCAMBIA质粒和pBI质粒。
3.根据权利要求1所述提高喜树碱产量的方法其特征在于重组载体含有异胡豆苷合成酶基因CrSTR和香叶醇-10-脱氢酶基因CrGlOH。
4.根据权利要求1所述提高喜树碱产量的方法其特征在于用含有重组载体的发根农杆菌菌株转化喜树下胚轴，获得毛状根。
5.根据权利要求1所述提高喜树碱产量的方法其特征在于喜树碱含量的检测方法为高效液相色谱法。
【专利摘要】本发明是一种生物技术领域的提高喜树毛状根中喜树碱含量的方法。从长春花中克隆出异胡豆苷合成酶基因CrSTR和香叶醇-10-脱氢酶CrGlOH的编码框序列，构建含上述双关键酶基因的植物双价高效表达载体，以发根农杆菌介导转化喜树获得转基因的喜树毛状根。本发明获得的转基因喜树毛状根中喜树碱含量显著提高，喜树碱含量达到对照的6.1倍，羟基喜树碱含量达到对照的2.8倍。本发明提供了一种提高喜树毛状根中喜树碱含量的方法，为生产具重要临床需求的抗癌药物喜树碱和羟基喜树碱提供了一种新途径。
【IPC分类】A01H5-00, C12N15-84
【公开号】CN104762317
【申请号】CN201410001193
【发明人】王文杰
【申请人】王文杰
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2014年1月3日