一种甜瓜低化瓜率种质的筛选方法及其所用pcr引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及农作物基因工程领域，具体设及一种甜瓜低化瓜率种质的筛选方法及 其所用PCR引物。
【背景技术】
[0002] 细胞延伸因子家族是一类通过与特异的、高亲和的细胞膜受体结合，调节细胞生 长与其他细胞功能等多效应的多肤类物质。主要存在于植物细胞的各种成体与及大多数培 养细胞中，对不同种类细胞具有一定的专一性。通常培养细胞的生长需要多种生长因子顺 序的协调作用，细胞延伸因子亦参与细胞与细胞外基质间重要的信号传导。生长因子类物 质自然存在于体内，是内源性的，为生植物生长、发育所必需，对植物的生长、发育具有广 泛调节作用。
[0003] 目前已经在拟南芥、水稻、小麦、玉米等多种作物中发现了细胞延伸因子，大多数 研究结果认为，延伸因子是一种组织特异性表达蛋白，分析表明在植物幼嫩发育组织中活 性较高。也有报道认为光照可显著提升大豆叶片中的EF1A的mRNA水平，影响小麦苗eEFlA 的稳定性。创伤、低氧可能诱导马铃馨块茎延伸因子基因的转录，2,4 -D处理后可提高转 基因烟草中eEFlA-GUS嵌合基因的mRNA水平。通过ommp(o皿iameamecumporto)mRNA 降解系统，研究4°C低温和水杨酸钢处理后，小麦、大麦eEFlAmRNA的稳定性，结果表明，品 种抗霜冻能力越强，eEFlAmRNA愈稳定。也有研究指出，在植物受到真菌感染后，组织坏死 阶段的eEFlA表达水平下降。此外，还与细胞增殖和衰老有关。总之，当植物受到外界环 境压力或者植物发育的内在信号时，会作出迅速反应，即通过改变eEFlA的表达（影响转 录水平或mRNA稳定性）调控蛋白质的合成，W适应各种环境条件和植物各个生长发育阶段 的需要。EF的相对稳定性可作为一种新颖的分子、遗传和生理标记。
[0004] 虽然在众多植物中已经发现大量细胞延伸因子EF基因的存在，但目前在甜瓜中EF被发现鉴定的数量较少，有关与甜瓜化瓜有关的基因EF的研究尚未见报道。在实际生产 当中，甜瓜坐果率是甜瓜非常重要的一个目标性状，坐果率的高低直接决定了甜瓜产量的 高低。一般而言，化瓜率高的品种产量较低。反之，低化瓜率的品种坐果能力较强。因此对 育种者而言，在种质筛选过程中，选择低化瓜率的品种就显得尤为重要，该也是品种具有高 产稳产性状的生物学基础。
[0005] 目前生产上主要是通过田间调查的方法，将所有种质资源播种，在开花坐果期统 计化瓜率，工作量大，费工费时，该种统计学方法也受低温、水肥等环境的干扰，影响育种效 率。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种甜瓜低化瓜率种质的 筛选方法及其所用PCR引物。
[0007] 前期研究表明，甜瓜苗期延伸因子的表达量和甜瓜化瓜率具有很高的相关性，因 此利用甜瓜内源延伸因子的基因表达量，通过反转录，检测甜瓜延伸因子转录量的高低，来 判定甜瓜化瓜率的高低，可W大大提高甜瓜种质选择的效率，对于提升甜瓜育种效率和生 产发展都具有十分重要的意义。因此甜瓜延伸因子基因对于瓜类作物改良具有非常重要的 理论和实践意义。
[0008] 为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：检测甜瓜CmEFs基因的PCR引物 对，是由序列表中序列1和序列2组成的引物对。
[0009] 正向引物（沈QIDNO;1) ;5-GGTTATGCTCCAGTCCTTGATT_ 3;
[0010]反向引物（SEQIDNO;2) ;5-CTGTTGGGTCCTTCTTCTCC- 3。
[0011] 本发明的第二个目的是提供了一种甜瓜低化瓜率种质的筛选方法，是采用上述 的引物对，对甜瓜CmEFs的RNA水平进行检测，提取甜瓜幼嫩叶片组织的RNA，并反转录为 cDNA作为检测样品，运用实时巧光PCR方法进行检测，得出CmEFs的表达水平，作为判断甜 瓜低化瓜率的判断依据，表达量高的材料即为低化瓜率种质。
[0012] 本发明的有益效果为：采用上述引物正对甜瓜CmEFs的RNA水平进行检测，提取甜 瓜幼嫩叶片组织的RNA，并反转录为cDNA作为检测样品，运用实时巧光PCR方法进行检测， 得出CmEFs的表达水平，作为判断甜瓜低化瓜率的判断依据，表达量高的材料即为低化瓜 率种质，统计学数据表明，本方法具有良好的特异性和实用性，可有效提高甜瓜种质选择的 效率。
【附图说明】
[0013] 图1为CmEFs基因表达量、田间实际化瓜率和坐果率统计数据图。
【具体实施方式】
[0014] 实施例1 ;
[0015] 根据甜瓜CmEFs基因的cDNA进行设计PCR检测引物，引物序列如下：
[0016] 正向引物（沈QIDN0:1) :5-GGTTATGCTCCAGTCCTTGATT-3;
[0017]反向引物（SEQIDN0:2) :5-CTGTTGGGTCCTTCTTCTCC-3。
[001引检测步骤：
[001 引 1)提取RNA;
[0020]将12份实验甜瓜种子置于28摄氏度条件下催芽2天，播种于育苗盘中，15天左 右长至两片真叶时，摘取叶片组织，在液氮中速冻，提取RNA(多糖多酪植物总RNA提取试剂 盒，天根公司）。
[002。。反转录；
[0022] 利用反转录试剂盒进行反转录（QuantScriptRTKit,天根公司）。获取甜瓜cDNA。 按1yg的量计算需加入的模板量进行逆转录。取出RNA模板置于冰上解冻，引物、10XRT Mix、dNTP、I?nase-Free(1地2〇与室温解冻，使用前混匀。
[0023]总RNA;2-10yl;
[0024]Oligo(dT) 1810ml；1y1；
[00巧]5XRTReactionMIX;4y1 ;
[0026]TUREscriptH-I?tase;0.8y1;
[0027]I?nasefree&0 至 20y1。
[0028] 按照下列体系将逆转录体系配制混合液，彻底混匀后分装置于冰上，按照各个样 品的浓度添加模板，离屯、后放于42°C解育50min，后再65°C加热15min失活TUREscript H-化ase。反应结束后再加入80ul化ase-Free(1地2〇,使终体积为lOOyl。
[0029] 3)Q-PCR(采用东洋纺QPS-201T);
[0030]PCR体系；20ul;
[0031] 2XQPCRMix；10y1 ；
[0032]化'讯〇'(1primer(10yM) ;0. 5y1 ;
[0033]Reverseprimer(10uM) ；0. 5y1 ；
[0034]Template；1y1 ；
[00巧]dd&O补至 20yl。
[0036]PCR程序；95°C5min;95°C10s、、6(TC30sX40 ;95°C15s60°C60s95°C15s(每 上升0.5°C收集一次信号）从冰箱取出2XQPCRMix放于超净工作台里面的冰盒中使其自 然解冻。解冻后上下颠倒混匀Mix,根据实验安排取出八连管放于PCR管盒中，根据实验管 数计算所需要加入的Mix、引物、水的量，取一只200y1PCR管，将上述试剂按计算的量加 入PCR管中，混匀后分装于八连管中，盖上盖子后离屯、。将八连管放入PCR仪中，设定程序， 进行Q-PCR实验。
[0037] 4)数据分析：
[0038] 根据S组实验结果数据，利用-AACt法计算CmEFs基因在不同样本中的相对表 达量。如表1和表2所示。表1为目标基因相对于内参基因Act;表2为目标基因表达量 的方差分析。图1显示为CmEFs基因表达量、田间实际化瓜率和坐果率统计数据。
[0039]表1
[0040]
【主权项】
1. 检测甜瓜CmEFs基因的PCR引物对，其特征在于，是由序列表中序列1和序列2组成 的引物对。
2. -种甜瓜低化瓜率种质的筛选方法，其特征在于，是采用权利要求1所述的引物对， 对甜瓜CmEFs的RNA水平进行检测，提取甜瓜幼嫩叶片组织的RNA，并反转录为cDNA作为检 测样品，运用实时荧光PCR方法进行检测，得出CmEFs的表达水平，作为判断甜瓜低化瓜率 的判断依据，表达量高的材料即为低化瓜率种质。
【专利摘要】本发明公开了一种甜瓜低化瓜率种质的筛选方法，是采用检测甜瓜CmEFs基因的PCR引物对，对甜瓜CmEFs的RNA水平进行检测，提取甜瓜幼嫩叶片组织的RNA，并反转录为cDNA作为检测样品，运用实时荧光PCR方法进行检测，得出CmEFs的表达水平，作为判断甜瓜低化瓜率的判断依据。本发明的有益效果为：采用上述引物对甜瓜CmEFs的RNA水平进行检测，提取甜瓜幼嫩叶片组织的RNA，并反转录为cDNA作为检测样品，运用实时荧光PCR方法进行检测，得出CmEFs的表达水平，作为判断甜瓜低化瓜率的判断依据，统计学数据表明，本方法具有良好的特异性和实用性，可有效提高甜瓜种质选择的效率。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104774917
【申请号】CN201410841068
【发明人】程鸿, 孔维萍
【申请人】甘肃省农业科学院蔬菜研究所
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2014年12月30日