用于等电聚焦分离两性电解质的试验装置及其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及蛋白质、多肽的分离和纯化技术领域。
【背景技术】
[0002]等电聚焦是一种重要的根据等电点分离肽、蛋白质等两性电解质的技术。早期的等电聚焦实验之所以往往难以与质谱检测技术匹配，是因为其中使用了高浓度的载体两性电解质。后来在CN101294930B《一种整体型固定化pH梯度的制备方法及其应用》专利文献中公开了一种无须在样品中添加自由载体两性电解质的毛细管等电聚焦方法，其中使用了整体型固定化PH梯度技术，载体两性电解质分子通过共价键固定于聚合物表面，但不失其酸碱两性及缓冲能力。为了分离复杂的生物样品，开发了窄梯度的整体型固定化pH梯度，其分辨率更高，可以进一步分离在宽整体型固定化pH梯度上不能分开的蛋白质谱带。
[0003]现有两性分子的等电聚焦分离方法通常在凝胶或封闭的管道中进行，聚焦结果的获得分别采用在凝胶上染色或迀移后检测的方法。聚焦后处理及聚焦组分的进一步研宄、应用受到限制，存在方法上的不足之处。
【发明内容】
[0004]本发明的目的就是要克服上述现有技术缺陷，研制一种用于等电聚焦分离两性电解质的试验装置。
[0005]本装置包括一底座，在底座的一侧开设一长条状凹槽，在设置所述长条状凹槽的底座一侧设置活动上盖，当上盖与底座合上时，对长条状凹槽形成密封。
[0006]本装置的长条状凹槽即为试验的分离通道，通过上盖的打开，可方便地装载或取出试验用非凝胶固体载体两性电解质，通过将上盖与底座的连接，可将非凝胶固体载体两性电解质密封于分离通道中。通过洗涤本装置，可反复使用，节省试验成本。
[0007]为了方便地接入电极，本发明还在上盖上，相对于所述长条状凹槽的两端分别开设正、负电极线插入通孔。
[0008]本发明还提出与以上试验装置相适应的试验方法，主要步骤如下:
O制备非凝胶态载体两性电解质；
2)打开上述装置的上盖，先将非凝胶态载体两性电解质按PH梯度顺序置于长条状凹槽中，再向长条状凹槽中加入待分离的两性电解质和磷酸盐缓冲溶液，再向放置pH值最低的非凝胶态载体两性电解质端的长条状凹槽内滴加磷酸水溶液，向放置PH值最高的非凝胶态载体两性电解质端的长条状凹槽内滴加氢氧化钠水溶液，待长条状凹槽中无空空和气泡后合上上盖，向放置PH值最低的非凝胶态载体两性电解质端施加正电极，向放置pH值最高的非凝胶态载体两性电解质端施加负电极，进行蛋白质等电聚焦分离；
3)待等电聚焦分离结束后，打开上盖，取出各段非凝胶态载体两性电解质进行分析。
[0009]实验后的白色固体非凝胶固体载体可经过清洗后反复使用，装置待取出再非凝胶态载体两性电解质后以用去离子水冲洗，等待下次使用。
[0010]本发明利用非凝胶固体载体两性电解质的缓冲能力及导电性，在特殊设计的上述装置中建立PH梯度，从而实现两性电解质样品(蛋白质或多肽)的等电聚焦分离、纯化。本发明装置的分离通道(长条状凹槽)既可以打开，也可以密封，方便样品及非凝胶固体载体两性电解质的添加与取出，因此非凝胶固体载体两性电解质是可以反复使用的。
【附图说明】
[0011]图1为本发明装置的一种结构示意图。
[0012]图2为图1的A-A向截面图。
[0013]图3为打开装置的上盖后置入成梯度非凝胶固体载体两性电解质后的示意图。
[0014]图4为标准蛋白质溶液等电聚焦的谱图。
[0015]图5为人肝细胞蛋白质提取溶液等电聚焦谱图。
[0016]图6为人体血清蛋白质溶液等电聚焦谱图。
[0017]图7为人体尿液提取蛋白质溶液等电聚焦谱图。
【具体实施方式】
[0018]—、装置说明:
如图1、2、3所示，试验装置设有一底座1，在底座I的一侧开设一长条状凹槽2，在设置所述长条状凹槽2的底座I 一侧设置活动上盖3，当上盖3与底座I合上时，对长条状凹槽2形成密封。
[0019]在上盖3上，相对于长条状凹槽3的两端分别开设正电极线插入通孔4和负电极线插入通孔5。
[0020]二、等电聚焦试验方法:
1、制备成梯度的白色固体非凝胶固体载体两性电解质:
按照CN101294930B公开的《一种整体型固定化pH梯度的制备方法及其应用》的技术方法合成非凝胶固体载体两性电解质:在10mL蒸馏水中加入1.0克丙烯酰胺、0.05克双丙烯酰胺、0.1克丙烯酸、0.1克烯丙基胺、0.025克过硫酸铵、0.01克亚硫酸氢钠，搅拌混匀，超声脱气10分钟，置于-20°C聚合10小时，得到白色固体非凝胶固体载体两性电解质。通过调节丙烯酸和烯丙基胺的用量比，可以取得一系列具有不同PH值的成梯度的白色固体非凝胶固体载体两性电解质，然后以蒸馏水充分洗涤备用。
[0021]2、试验过程:
如图3所示，将上述所制备的八段白色固体非凝胶固体载体两性电解质按pH梯度的顺序放入长条状凹槽2内，并充满长条状凹槽2的长度。再将ImL蛋白质样品和0.20 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 8.6)加入长条状凹槽2，确定不存在空穴及气泡。然后向放置pH值最低的非凝胶态载体两性电解质端(即试验电极的正极端)的长条状凹槽2内滴加0.5 mol/L磷酸水溶液，向放置pH值最高的非凝胶态载体两性电解质端(即试验电极的负极端)的长条状凹槽2内滴加氢氧化钠水溶液。合上上盖，压紧密封。
[0022]从上盖的两个正电极线插入通孔4和负电极线插入通孔5中分别插入正、负电极，并使正电极与PH小的一端通道内的白色固体非凝胶固体载体相接触，使负电极与pH在的一端通道内的白色固体非凝胶固体载体相接触，通电(根据分离通道的长度，施加+200kV/cm)即进行反应。
[0023]30分钟后，断电，打开上盖，取出样品聚焦分离所得到的蛋白质区带。将所得到的蛋白质区带进行下一步聚焦谱带分析。
[0024]3、材料和装置的重复使用说明:
实验后的白色固体非凝胶固体载体可重复使用，方法是:以10 mmol/L十二烷基磺酸钠和去离子水对实验后的白色固体非凝胶固体载体充分洗涤，干燥备用。装置再使用方法:用去离子水对装置冲洗，等待下次使用。
[0025]试验实例1:
按照上述方法进行实验，其中蛋白质样品是标准蛋白质溶液(浓度均为0.5 mg/mL)。聚焦完成后得到结果如图4所示:1胃蛋白酶；2卵清蛋白；3牛血红蛋白；4溶菌酶，说明蛋白质分离已经完成。
[0026]试验实例2:
按照上述方法进行实验，其中蛋白质样品是人肝细胞蛋白质提取溶液。聚焦完成后得到结果如图5所示，说明蛋白质分离已经完成。
[0027]试验实例3:
按照上述方法进行实验，其中蛋白质样品是人体血清蛋白质溶液。聚焦完成后得到结果如图6，说明蛋白质分离已经完成。
[0028]试验实例4:
按照上述方法进行实验，其中蛋白质样品是人体尿液提取蛋白质溶液。聚焦完成后得到结果如图7，说明蛋白质分离已经完成。
【主权项】
1.一种用于等电聚焦分离两性电解质的试验装置，其特征在于包括一底座，在底座的一侧开设一长条状凹槽，在设置所述长条状凹槽的底座一侧设置活动上盖，当上盖与底座合上时，对长条状凹槽形成密封。
2.根据权利要求1所述用于等电聚焦分离两性电解质的试验装置，其特征在于在上盖上，相对于所述长条状凹槽的两端分别开设正、负电极线插入通孔。
3.如权利要求1或2所述试验装置的使用方法，包括以下步骤: O制备非凝胶态载体两性电解质； 2)打开上述装置的上盖，先将非凝胶态载体两性电解质按PH梯度顺序置于长条状凹槽中，再向长条状凹槽中加入待分离的两性电解质和磷酸盐缓冲溶液，再向放置pH值最低的非凝胶态载体两性电解质端的长条状凹槽内滴加磷酸水溶液，向放置PH值最高的非凝胶态载体两性电解质端的长条状凹槽内滴加氢氧化钠水溶液，待长条状凹槽中无空空和气泡后合上上盖，向放置PH值最低的非凝胶态载体两性电解质端施加正电极，向放置pH值最高的非凝胶态载体两性电解质端施加负电极，进行蛋白质等电聚焦分离； 3)待蛋白质等电聚焦分离结束后，打开上盖，取出各段非凝胶态载体两性电解质进行分析。
【专利摘要】用于等电聚焦分离两性电解质的试验装置及其使用方法，涉及蛋白质、多肽的分离和纯化技术领域。在底座的一侧开设一长条状凹槽，在设置所述长条状凹槽的底座一侧设置活动上盖，当上盖与底座合上时，对长条状凹槽形成密封。本装置的长条状凹槽即为试验的分离通道，通过上盖的打开，可方便地装载或取出试验用非凝胶固体载体两性电解质，通过将上盖与底座的连接，可将非凝胶固体载体两性电解质密封于分离通道中。通过洗涤本装置，可反复使用，节省试验成本。
【IPC分类】C07K1-28
【公开号】CN104788536
【申请号】CN201510207292
【发明人】杨春, 刘国峰
【申请人】扬州大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月28日