一种伪狂犬病病毒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于家畜病源微生物筛选技术领域，具体涉及一种伪狂犬病病毒及其在制 备疫苗中的应用。
【背景技术】
[0002] 猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV)属于痕疼病毒科a痕疼病毒亚科猪 疱瘆病毒I型，猪是该病毒的唯一自然宿主，引起猪的伪狂犬病（Pseudorabies，PR)。该病 在猪群多呈暴发流行，主要危害母猪群，引起母猪流产或垂直传播给仔猪，造成初生仔猪大 量死亡，给我国乃至全球的养猪业带来了巨大的经济损失。目前尚无治疗PR的有效药物， 因此疫苗接种成为控制该病发生和流行的主要措施。世界上使用最广泛的疫苗主要是PRV Bartha-K61株疫苗，然而近几年我国猪伪狂犬疫病流行现状为现有该疫苗不能完全保护新 流行PRV的攻击，给免疫猪场造成了一定的经济损失。因此，需要在国内分离新的流行株， 并对其毒力基因进行缺失，获得一株新的PRV基因缺失疫苗来预防该病毒对养殖业的侵 袭。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种猪伪狂犬病病毒及其在制备疫苗中的应用；用该病毒制 备的疫苗具有高效、安全性好、保护率高的优点，从而为猪伪狂犬病防控措施的制定提供可 靠的依据。
[0004] 本发明提供的猪伪狂犬病病毒QD株（疱瘆病毒I型Porcine herpesvirus Type I )已于2015年3月6日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物 研宄所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 10266。
[0005] 上述的猪伪狂犬病病毒为PRV QD株。
[0006] 本发明的猪伪狂犬病病毒用于制备疫苗。
[0007] 本发明筛选的猪伪狂犬病病毒具有安全性好，且保护率高的特点，用本发明猪伪 狂犬病病毒PRV QD株接种Vero细胞，收获细胞毒液，提取该分离株的DNA，采用基因工程 的方法对该分离株进行毒力基因 TK和gE基因的缺失，并在细胞上进行拯救后，繁毒，加入 保护剂后制成疫苗。制成的疫苗对仔猪的保护率为1〇〇%，效果明显优于Bartha-K61组 (20% )，此疫苗具有高效、安全性好的优点。
【具体实施方式】
[0008] 下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。
[0009] 实施例1 :猪伪狂犬病病毒的分尚
[0010] 最近几年我国多个猪场都发生了伪狂犬病，其中大部分是种猪场，而发病猪群之 前已经注射了伪狂犬疫苗，推测感染的病毒发生了变异；因此从发病猪群中进行了猪伪狂 犬病毒的筛选。 toon] 取发病猪内脏样本，包括：心脏、肝脏、肺脏、脾脏、扁桃体和淋巴结等。将内脏样 本与PBS (0. 1M，pH7. 2)以V/V1:5制成匀浆，反复冻融3次，3000r/min离心15min，取上清中 加双抗，37°C感作lh，经0. 22 μ m滤膜过滤除菌。取Iml病毒滤液接种于长成单层的Vero 细胞，盲传三代，观察细胞病变（CPE)。将出现CPE的细胞培养液进行空斑纯化，纯化后的病 毒分装保存至_70°C备用，并测定病毒含量。
[0012] 实施例2 :筛选的猪伪狂犬病病毒的培育及鉴定
[0013] 1.培育将筛选的猪伪狂犬病病毒命名为PRV QD株，经PCR鉴定该毒株为强毒，经 Vero细胞培养驯化，病毒含量达107_°TCID5Q/0.1 ml以上。该病毒已于2015年3月6日保藏 于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄所的中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 10266。
[0014] 2.鉴定
[0015] 2.1弓丨物设计参照已发表的PRV gE基因片段，采用Oligo 7.0设计1对引物扩 增全长：
[0016] F1:5r -ATGCGGCCCTTTCTGCTGCGCGCC-3r ；
[0017] F2:5，-TTAAGCGGGGCGGGACATCAACAGGd 〇
[0018] 2.2鉴定结果对于本发明筛选的毒株进行PCR检测，测序后进行blast分析，发 现保藏编号为CGMCC No. 10266的猪伪狂犬病病毒的gE基因与2012年之后报道的猪伪狂 犬病病毒的相对应的序列虽然存在至少2个氨基酸的差异，但是亲缘关系较近，均处于一 个相对独立的分支中，与之前分离的毒株亲缘关系较远。且与最近分离的毒株具有相同的 分子特征，即在gE基因第48位和第492-496位各有1个天冬氨酸的插入，其他报道也证实 也这一点。而以前分离到的毒株只个别有一个位置插入氨基酸，绝大部分没有插入。因此 可以推测上述的差异正是导致已有的猪伪狂犬病病毒疫苗免疫效果不佳的原因所在。
[0019] 该毒株作100倍稀释后，与等量猪伪狂犬病病毒抗血清中和，病毒均能被尚免血 清特异性中和；而与等量猪细小病毒、猪流感病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼 吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒抗血清中和组，细胞呈现明显的 细胞病变，可见该病毒特异性好。该毒株制备的疫苗免疫BALB/C小鼠后，能降低小鼠的死 亡率。
[0020] 2.3毒种保存由表内结果可见，本发明分离毒湿毒在_70°C保存36个月病毒含 量仍较稳定。（参见表1)
[0021] 表1 :保存不同时间病毒含量测定
[0022]
【主权项】
1. 一种猪伪狂犬病病毒，其特征在于，所述的猪伪狂犬病病毒的保藏编号为CGMCC No.10266。
2. 权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒为PRV QD株。
3. 权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒在制备疫苗的减毒病毒株中的应用。
4. 一种减毒病毒株，其特征在于，所述的减毒病毒株是由权利要求1所述的猪伪狂犬 病病毒在进行毒力基因缺失后，在细胞上进行拯救获得的。
5. 如权利要求4所述的减毒病毒株，其特征在于，所述的毒力基因为TK、gE和gl基因。
6. 权利要求4所述的减毒病毒株在制备疫苗中的应用。
【专利摘要】本发明的目的是提供一种猪伪狂犬病病毒及其在制备疫苗中的应用，本发明提供的猪伪狂犬病病毒的保藏编号为CGMCC No.10266。本发明筛选的猪伪狂犬病病毒具有安全性好，且保护率高的特点，用本发明猪伪狂犬病病毒PRV-QD株接种Vero细胞，收获细胞毒液，提取该分离株的DNA，采用基因工程的方法对该分离株进行毒力基因TK、gE和gI基因的缺失，并在细胞上进行拯救后，繁毒，加入保护剂后制成疫苗。制成的疫苗对仔猪的保护率为100％，效果明显优于Bartha-K61组(20％)，此疫苗具有高效、安全性好的优点。CGMCC No.1026620150306
【IPC分类】C12N7-00, A61K39-245, C12R1-93, C12N7-04, A61P31-22
【公开号】CN104805060
【申请号】CN201510246420
【发明人】李明义, 刘杉杉, 孙伟, 刘阳, 李晓林, 赵航, 李彦凤, 葛栋, 李佳琪
【申请人】山东信得科技股份有限公司
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年5月15日