一种3-羟基丙酸高产菌重组质粒的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化工生产领域，涉及一种高产3-羟基丙酸基因工程菌重组质粒 的构建方法。
【背景技术】
[0002] 3-羟基丙酸（3-HP)在工业应用上有很高的商业价值，但其化学合成方法较为复 杂。近年来，随着合成生物学成为生物化工的研宄热点，微生物合成法产3-羟基丙酸亟待 突破。肺炎克雷伯氏杆菌（Klebsiella pneumoniae)具有较强的甘油代谢能力，从生物量 积累的角度来看很适合作表达宿主。肺炎克雷伯氏杆菌利用甘油生成中间产物3-羟基丙 醛，然后3-羟基丙醛被醛脱氢酶催化生成3-羟基丙酸。
[0003] 在以肺炎克雷伯氏杆菌为宿主菌生产3-羟基丙酸的方法中，工程菌所用的启动 子多为来自于dhaB基因自身的pk启动子。该启动子具有启动能力弱，从而使蛋白表达量 小等缺点，影响了 3-羟基丙酸的产量。因此，寻找出一种适合于肺炎克雷伯氏杆菌的强效 启动子和产3-羟基丙酸的醛脱氢酶来构建工程菌成为了高产3-羟基丙酸的突破口。
[0004] 经过大量筛选，发现tac启动子启动能力强，且适用于肺炎克雷伯氏杆菌。于是， 创立了一种构建3-羟基丙酸高产工程菌的方法，在tac启动子后面连接上醛脱氢酶基因 puuC，测定了醛脱氢酶puuC的蛋白表达量和体内外酶活性。结果显示，醛脱氢酶在tac启 动子的作用下得到了超表达。在此基础上，测定了 3-羟基丙酸产量，得到了高产3-羟基丙 酸工程菌。
【发明内容】
[0005] 鉴于现有产3-羟基丙酸工程菌产量大都较低，本发明旨在创立一种3-羟基丙酸 高产工程菌的方法，并确定了该工程菌发酵的最佳培养条件。本发明的技术方案概述如 下：
[0006] 一种生产3-羟基丙酸菌株的重组质粒，其特征在于：导入了 tac启动子和PimC醛 脱氣酶基因。
[0007] 进一步，所述重组质粒被导入于肺炎克雷伯氏菌。
[0008] -种构建所述重组质粒的方法，包括以下步骤：
[0009] 1)将启动子tac和醛脱氢酶基因 puuC插入载体质粒中，构建重组质粒 pET (ptac-puuC)；
[0010] 2)用所构建的重组质粒转化到肺炎克雷伯氏菌中。
[0011] 进一步，其特征在于所述构建重组质粒包括：
[0012] 1)含有puuC基因的DNA片段的PCR扩增；
[0013] 2)限制性内切酶切割载体质粒和基因 puuC、ptac ;
[0014] 3)将puuC基因和启动子ptac插入所述载体质粒中。
[0015] 一种生产3-羟基丙酸的方法，是对导入了含有tac启动子和醛脱氢酶基因 puuC 的pET-28a重组质粒的肺炎克雷伯氏菌进行发酵培养，并自发酵液中获得3-HP。
[0016] 进一步，所述发酵液为！K2HPO4 · 3H20 4-6g/L、KH2PO4L 5-2. 4g/L、 (NH4) 2S046. 4-9. 6g/L、MgSO4 · 7H20 0· 1-0. 2g/L、酵母粉 3· 2-4. 8g/L、IPTG 浓度为 0. 015-0. 025mM、以及甘油含量维持到30g/L以上。
[0017] 进一步，所述发酵培养为流加培养方式，使pH恒定于6. 5-7. 5之间，通气量保持在 1. 5vvm，揽拌转速为400rpm〇
[0018] ptac-puuC基因序列具有如NO. 1的基因序列。
[0019] 经过大量筛选，发现了适用于肺炎克雷伯氏杆菌的高效tac启动子以及能转化 3-羟基丙醛为3-羟基丙酸的puuc醛脱氢酶，并以此构建重组工程菌。将该酶编码基因的 序列进行分析后，对该基因进行了化学合成。测序验证后将该启动子和酶在肺炎克雷伯氏 杆菌中超表达，获得了重组肺炎克雷伯氏杆菌pET (ptac-puuc)，测定其体内及体外对3-轻 基丙醛的催化能力。在体外，该酶对3-羟基丙醛的酶活达到26. 31U/mg，是原代肺炎克雷 伯氏杆菌（3. 82U/mg)的6. 9倍。在5L发酵罐中培养改造后的工程菌，经培养基成分、IPTG 浓度条件优化后，其48h后3-羟基丙酸产量高达73g/L。
【附图说明】
[0020] 图1重组肺炎克雷伯氏杆菌pET (ptac-puuC)的SDS-PAGE分析图.
[0021] M-marker ； 1-K. pneumoniae(ptac) ；2~K.pneumoniae(ptac-puuC)
[0022] 图2不同浓度培养基成分对3-羟基丙酸和生物量的影响.
[0023] A = K2HPO4 · 3H20 ;B:KH2P04;C: (NH4) 2S04;D = MgSO4 · 7H20 ;E: Yeast extract (酵母 粉）.Biomass:生物量；3-HP :3_ 羟基丙酸；Lactic acid:乳酸；Acetic acid:乙酸
[0024] 图3不同浓度的IPTG对重组菌的影响
[0025] Biomass:生物量；3-HP :3_ 羟基丙酸；Lactic acid :乳酸；Acetic acid:乙酸
[0026] 图4重组菌Κ· pneumoniae (ptac-puuC)的上罐发酵图
[0027] 3-HP :3_ 羟基丙酸；Lactic acid :乳酸；Acetic acid :乙酸；
[0028] 1，3-PD: 1，3-丙二醇；1，3_PD:2, 3- 丁二醇；Biomass:生物量
【具体实施方式】
[0029] 下面的具体方法可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限 制本发明。
[0030] 本发明方法的具体步骤包括：
[0031] 1.肺炎克雷伯氏杆菌中tac启动子和醛脱氢酶puuc的克隆
[0032] 菌株及质粒：大肠杆菌（E. coli) toplO购自北京博迈德公司，肺炎克雷伯氏杆菌 (Klebsiella pneumoniae)DSM2026从德国DSM购买，表达载体pET-28a从诺维信公司购买。
[0033] 培养基：LB培养基（g/L)蛋白胨10,酵母粉5, NaCl 10,固体培养基中加入1. 5% (100ml液体培养基中加入I. 5g琼脂）的琼脂。抗性培养基需加入50 μ L/mL硫酸卡那霉 素。
[0034] 肺炎克雷伯氏杆菌发酵培养基（g/L) !K2HPO4 · 3H20,3. 4 ;KH2P04,1. 3 ; (NH4)2SO4, 4 ;MgS04 · 7Η20,0· 5 ;CaC03,0.1 ;酵母粉，3 ;甘油，40 ;微量元素，I. 25mL/L(lL 培养基中加入 I. 25mL微量元素）。
[0035] 微量元素溶液（g/L)FeS04 · 7H20,1 ;ZnCl2,0. 07 ;CuCl2 · 2Η20,0· 02 ;MnCl2 · 4H20， 0· I ;NiCl2 · 6Η20,0· 025 ;H3B03,0 . 06 ;Na2M04 · 2Η20,0· 035 ;CoC12 · 2Η20,0· 2 ;饱和 HC1，4mL。
[0036] 分子克隆及表达：将筛选得到的基因序列进行化学合成，连接至载体pET_28a中， 得到重组质粒pET (ptac-puuC)，转入大肠杆菌toplO中进行测序验证。之后将提取的质粒 电穿孔转化至肺炎克雷伯氏杆菌并进行验证。验证结果显示tac启动子和醛脱氢酶基因 puuC连接正确。
[0037] 2.醛脱氢酶的表达
[0038] 在发酵培养基中培养重组菌，在第12h取出发酵液，12000rpm离心10min，去上 清。将收集到的菌体用 50mM 的 PBS 缓冲液（ΚΗ2Ρ04,0· 27g/L ;Na2HP04,1. 42g/L ;NaCl，8g/L ; KC1，0. 2g/L)重悬。随后将菌体置于冰上，超声破碎细胞，功率为100W，工作3s，停止2s，共 50次。破碎后将适量破碎液加入到酶活反应体系（50mM PBS缓冲液，0.2mM 3-羟基丙醛， 0. 4mM氨基安替比林，7mM苯酷，7U过氧化氢酶）中，37°C进行反应5min后在500nm下测定 吸光度。一个活力单位定义为在该条件下，Imin催化生成1 μ mol过氧化氢所需要的酶量。
[0039] 测定puuC醛脱氢酶的SDS-PAGE蛋白电泳。
[0040] 实验结果表明，醛氧化酶在体外对3-羟基丙醛的活性达到了 26. 31U/mg，为对照 组的5. 9倍。
[0041] 3.最佳培养条件的确定
[0042] 根据摇瓶发酵确定重组菌产3-羟基丙酸的最佳培养条件。
[0043] 在250ml摇瓶中装入IOOrnl发酵培养基，置于摇床中，37°C且150rpm条件下进行 摇瓶发酵。每隔3h取出一次发酵液进行3-羟基丙酸产量的测定。分析方法如下：发酵液 中的产物质量浓度采用岛津高效液相色谱SPD-20A测定，色谱柱为C18柱，柱温30°C，流动 相为0.05%磷酸，工作流速为0.8111171^11，检测器采用紫外检测器。取11^发酵液12000印111 离心10min，取上清液用于高效液相色谱检测，样品分析前经0. 22 μ m微滤膜过滤。甘油的 测定方法使用的是高碘酸钠氧化法。
[0044] 培养基成分的确定：
[0045] 根据摇瓶发酵条件图2示，得到最佳培养基成分配制范围：
[0046] 表1最佳培养基成分
[0047]
【主权项】
1. 一种生产3-羟基丙酸菌株的重组质粒，其特征在于：导入了 tac启动子和puuC醛 脱氣酶基因。
2. 根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒被导入于肺炎克雷伯 氏菌。
3. -种构建权利要求2所述重组质粒的方法，包括以下步骤： 1) 将启动子tac和醛脱氢酶基因puuC插入载体质粒中，构建重组质粒 pET (ptac-puuC)； 2) 用所构建的重组质粒转化到肺炎克雷伯氏菌中。
4. 根据权利要求3所述方法，其特征在于所述构建重组质粒包括： 1) 含有puuC基因的DNA片段的PCR扩增； 2) 限制性内切酶切割载体质粒和基因puuC、ptac ; 3) 将puuC基因和启动子ptac插入所述载体质粒中。
5. -种生产3-羟基丙酸的方法，是对导入了含有tac启动子和醛脱氢酶基因puuC的 pET-28a重组质粒的肺炎克雷伯氏菌进行发酵培养，并自发酵液中获得3-HP。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述发酵液为：K 2HP04 ? 3H20 4-6g/L、 KH2PO4 I. 5-2. 4g/L、（NH4)2SO4 6. 4-9. 6g/L、MgSO4 ? 7H20 0? 1-0. 2g/L、酵母粉 3. 2-4. 8g/L、 IPTG浓度为0. 015-0. 025mM、以及甘油含量维持到30g/L以上。
7. 根据权利要求5或6所述方法，其特征在于：所述发酵培养为流加培养方式，使pH恒 定于6. 5-7. 5之间，通气量保持在I. 5vvm，搅拌转速为400rpm。
8. 根据权利要求1所述的重组质粒，具有如NO. 1的ptac-puuC基因序列。
【专利摘要】一种3-羟基丙酸高产菌重组质粒的构建方法属于生物化工生产领域。鉴于现有产3-羟基丙酸工程菌产量大都较低，发现了适用于肺炎克雷伯氏杆菌的高效tac启动子以及能转化3-羟基丙醛为3-羟基丙酸的puuc醛脱氢酶，并以此构建重组工程菌。将该酶编码基因的序列进行分析后，对该基因进行了化学合成。测序验证后将该启动子和酶在肺炎克雷伯氏杆菌中超表达，获得了重组肺炎克雷伯氏杆菌pET(ptac-puuc)，测定其体内及体外对3-羟基丙醛的催化能力。在体外，该酶对3-羟基丙醛的酶活达到26.31U/mg，是原代肺炎克雷伯氏杆菌(3.82U/mg)的6.9倍。在5L发酵罐中培养改造后的工程菌，经培养基成分、IPTG浓度条件优化后，其48h后3-羟基丙酸产量高达73g/L。
【IPC分类】C12N1-21, C12R1-22, C12N15-74, C12P7-42
【公开号】CN104805112
【申请号】CN201510188882
【发明人】田平芳, 陈柳霓, 李映
【申请人】北京化工大学
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年4月20日