雷蒙德氏棉功能着丝粒序列及其分子标记的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物信息学与分子细胞遗传学领域，具体涉及雷蒙德氏棉功能着丝粒 序列及其分子标记。
【背景技术】
[0002] 着丝粒是高等真核生物染色体上重要的功能元件。在细胞有丝分裂和减数分裂过 程中负责染色体的均等分离，从而起到确保遗传物质稳定传递的重要作用。由于着丝粒区 域富含重复序列，难以进行测序组装，因此，其研宄相对落后。例如，尽管人、果蝇和拟南芥 等模式生物的全基因组测序早已完成，但其着丝粒因含有大量重复序列，往往仍然以不同 长度的gap存在于基因组测序图谱上，无法被解析。因此，着丝粒的研宄无论对于其生物学 特性的揭示，还是基因组测序等研宄领域都有着重要意义。
[0003] 随着着丝粒研宄的深入，人们发现，与广义的着丝粒即染色体上主缢痕的定义 不同，着丝粒行使功能的区域普遍存在着一种特异组蛋白H3,即CENH3,因此，科研工作 者将真正意义上的着丝粒定义为与着丝粒特异组蛋白结合的染色质区域，即功能着丝 粒区。与此同时，由于CENH3在着丝粒定义中的重要意义，它已经被作为识别着丝粒功 能区域和功能着丝粒DNA序列发掘的特殊标记。染色质免疫共沉淀技术（Chromatin immunoprecipitationassay,ChIP)是研宄生物体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法， 因此，这一方法也成为功能着丝粒序列发掘的有效手段。该方法与第二代高通量测序技术 相结合（ChIP-Seq)可以在全基因组水平高效地分离、分析功能着丝粒DNA序列，目前已被 广泛应用于功能着丝粒的研宄中。
[0004] 近年来，棉花基因组研宄发展迅速，然而，棉花着丝粒的研宄鲜有报道，而且仅有 的报道基本上是以随机的DNA序列分析、筛选为主，无法确定DNA序列是否与CENH3结合， 故其作为功能着丝粒序列的真实性有待商榷。本发明利用CENH3抗体进行ChIP-Seq实验， 分析得到了四条雷蒙德氏棉功能着丝粒序列，其与CENH3绑定关系明确，并且通过FISH实 验的进一步验证，明确了这些序列的着丝粒定位及其功能着丝粒序列的特性。同时，为了方 便应用，我们根据其序列开发了相应地特异引物，为其克隆及应用提供了有力的工具。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是发掘雷蒙德氏棉功能着丝粒序列，并开发其相应的分子标记，有 利于棉花遗传图谱和物理图谱的构建，还有利于着丝粒形成与功能行使机制的探讨，也能 够为棉花人工染色体的构建提供必需的序列信息。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 雷蒙德氏棉功能着丝粒序列，所述序列根据ChIP-Seq数据分析得到，名称分别为：序 列l_Cluster201Contig81、序列 2_Cluster285Contig8、序列 3_Cluster291Contig8、序列 4-Cluster407Contig2,其核苷酸序列分别为SEQIDNO. 1-4所示。
[0007] 所述的序列l_Cluster201Contig81、序列 2_Cluster285Contig8、序列 3_Cluster291Contig8和序列4_Cluster407Contig2相应的分子标记引物序列如SEQID NO. 5-12 所示。
[0008] 表1雷蒙德氏棉功能着丝粒序列相应的分子标记
【主权项】
1. 雷蒙德氏棉功能着丝粒序列，其特征在于，所述序列根据ChIP-Seq数据分 析得到，名称分别为：序列l_Cluster201Contig81、序 2_Cluster285Contig8、序列 3-Cluster291Contig8、序列 4-Cluster407Contig2,其核苷酸序列分别为SEQIDNO. 1-4 所 不O
2. -种如权利要求1所述的雷蒙德氏棉功能着丝粒序列的分子标记，其特征在于：所 述的序列l_Cluster201Contig81、序列 2_Cluster285Contig8、序列 3_Cluster291Contig8 和序列4-Cluster407Contig2相应的分子标记引物序列如SEQIDNO. 5-12所示。
3. -种如权利要求1所述的雷蒙德氏棉功能着丝粒序列在功能着丝粒的定位及相关 序列的鉴定上的应用。
4. 一种如权利要求2所述的雷蒙德氏棉功能着丝粒序列的分子标记在棉花遗传图谱 着丝粒位置的遗传定位上的应用。
【专利摘要】本发明提供了雷蒙德氏棉功能着丝粒序列及其相应的分子标记。我们利用染色质免疫共沉淀与高通量测序技术相结合（ChIP-Seq）的方法得到了雷蒙德氏棉功能着丝粒区域的四条DNA序列。根据该序列分别设计引物，用于雷蒙德氏棉有丝分裂中期荧光原位杂交（FISH）。结果显示，这四条序列均在全部染色体的着丝粒区域产生集中且清晰明亮的信号。本发明的着丝粒序列可直接用于功能着丝粒的定位及相关序列的鉴定；所开发的标记可用于棉花遗传图谱着丝粒位置的遗传定位，为功能基因定位及连锁关系提供更加准确的信息，也能为雷蒙德氏棉全基因组测序的序列拼接提供借鉴和帮助，使得其物理图谱信息更加全面。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104818331
【申请号】CN201510225766
【发明人】王凯, 韩金磊, 张文盼, 俞丽英, 单文波, 林爱婷
【申请人】福建农林大学
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年5月6日