一种羰基还原酶及其在制备(r)-奎宁醇中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，具体涉及一种羰基还原酶，含有编码该酶的核苷酸序 列的重组表达载体和重组表达转化体，表达的重组酶和该重组酶的制备方法，以及该羰基 还原酶作为催化剂在不对称合成（R)-奎宁醇中的应用。
【背景技术】
[0002] 膀胱过度活动症（OAB)是一种以尿急症状为特征的症候群，常伴有尿频和夜尿症 状，可伴或不伴有急迫性尿失禁，其明显影响患者的日常生活和社会活动，已成为困扰人们 的一大疾病。近年来随着我国进入老龄化社会，以及糖尿病与神经系统损害性疾病的增长， 由此继发的相关疾病--膀胱过度活动症的发生率也逐年上升。
[0003] 《膀胱过度活动症诊断治疗指南》中指出：OAB是一种以尿急症状为特征的综合征， 常伴有尿频和夜尿症状，可伴或不伴有急迫性尿失禁；尿动力学上可表现为逼尿肌过度活 动，也可为其他形式的尿道一一膀胱功能障碍。不包括由急性尿路感染或其他形式的膀胱 尿道局部病变所致的症状。
[0004] 对于OAB的药物治疗，主要有以下几种：
[0005] (1)M受体拮抗剂药物治疗容易被大多数OAB患者接受，因而是OAB最重要和最基 本的治疗手段。逼尿肌的收缩通过激动胆碱能（M受体）介导，M受体拮抗剂可通过拮抗M 受体，抑制逼尿肌的收缩，改善膀胱感觉功能，抑制逼尿肌不稳定收缩可能，因此被广泛应 用于治疗OAB。一线药物有托特罗定、曲司氯胺、索利那新等，其他药物有奥昔布宁、丙哌唯 林、普鲁苯辛等。
[0006] (2)镇静、抗焦虑药。中枢神经系统的多个区域参与了排尿控制，如皮质和间脑以 及中脑、延髓和脊髓。可选择与这些神经通路有关的神经递质如Y-氨基丁酸、5-羟色胺、 多巴胺和谷氨酸等。OAB的治疗药物中，最常用的是丙米嗪，不仅有抗胆碱及拟交感作用，还 可能有中枢性抑制排尿反射的作用，被推荐用于治疗混合性急迫、压力性尿失禁。但丙米嗪 起效较慢，服用数周后才能见效。不良反应有体位性低血压及心律失常。另一抗抑郁药物 度洛西汀，通过抑制中枢对5-羟色胺和去甲肾上腺素的再摄取，增加尿道外括约肌张力。
[0007] (3)钙通道阻断剂实验证明，钙拮抗剂如维拉帕米、硝苯地平等可通过阻滞细胞外 钙离子内流从而抑制膀胱逼尿肌的收缩；钾离子通道开放剂则通过增加钾离子外流，引起 细胞膜超极化，使平滑肌松弛。
[0008] (4)其他药物前列腺素合成抑制剂（吲哚美辛）、黄酮哌酯等。
[0009] 其中，索非那新（solifenacin)是新一代M3受体诘抗剂，迄今已在全球50多个国 家和地区上市销售，已成为欧洲、美国和日本市场膀胱过度活动症（0AB)治疗的领导品牌， 受到多个权威机构和指南的推荐。现有技术中对于索非那新的合成主要包括化学法和生物 法两种：
[0010] 化学法主要包括拆分的方法，比如，美国专利US5744606A中公开了 3-喹宁酮与路 易斯酸成盐，然后在铑、铱或钌与手性二膦配体作为光学活性的复合物催化下生成（R)-喹 宁醇，如下所示：
[0011]
【主权项】
1. 一种羰基还原酶，其是如下（a)或（b)的蛋白质： (a) 由SEQ ID No: 2所示氨基酸序列组成的蛋白质； (b) 在（a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的具有 羰基还原酶活性的蛋白质。
2. 编码权利要求1所述的羰基还原酶的分离的核酸。
3. 根据权利要求2所述的核酸，其是由SEQ ID No: 1所示的核苷酸序列组成的。
4. 包含权利要求2或3所述的核酸的重组表达载体。
5. 根据权利要求4所述的重组表达载体，其选自质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体。
6. 根据权利要求5所述的重组表达转化体，其是pET21a。
7. 包含权利要求4-6任一项的重组表达载体的重组表达转化体。
8. 根据权利要求7所述的重组表达转化体，其是大肠杆菌（凡cWi)。
9. 根据权利要求8所述的重组表达转化体，其是凡co/i BL21 (DE3)。
10. -种重组羰基还原酶的制备方法，包括培养权利要求7-9中任一项所述的重组表 达转化体，以及从培养物中获得重组羰基还原酶。
11. 一种催化3-奎宁酮进行不对称还原反应形成（R)-奎宁醇的催化剂，其选自权利要 求7-9任一项所述的重组表达转化体的培养物，或通过将该培养物离心分离后得到的转化 体细胞或者用其加工的制品；优选地，所述加工的制品是由转化体细胞得到的提取物、或通 过对提取物中的羰基还原酶进行分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定化转化体 细胞或提取物或转化体的分离产品而得到的固定化制品。
12. 权利要求1所述的羰基还原酶、权利要求10所述的方法制备的重组羰基还原酶或 权利要求11所述的催化剂在催化3-奎宁酮进行不对称还原反应形成（R)-奎宁醇中的应 用。
13. 根据权利要求12所述的应用，其特征在于所述的应用包括下述步骤：在葡萄糖脱 氢酶、葡萄糖存在下，在权利要求1所述的羰基还原酶、权利要求10所述的方法制备的重 组羰基还原酶或权利要求11所述的催化剂的催化下，3-奎宁酮进行不对称还原反应，得到 (R)-奎宁醇。
14. 根据权利要求13所述的应用，其特征在于：所述的3-奎宁酮在反应液中的浓度为 10~400g /L;所述的羰基还原酶为200~1000 U/L;NAD+为0·01~0·5 mmol/L;葡萄糖脱氢酶 为5000 U/L ;葡萄糖为10~500 g/L ;所述的水溶液为pH范围在5. 0~8. 0的缓冲液，所述缓 冲液的浓度较佳地为〇. 05~0. 2 mol/L ;所述的不对称还原反应在振荡或搅拌条件下进行； 所述的不对称还原反应的温度为20~40°C，优选30°C。
【专利摘要】本发明提供了一种新的羰基还原酶及利用重组羰基还原酶结合辅酶进行不对称还原的方法。在催化浓度高达400g/L的底物时，产物的光学纯度仍高达99%以上，且不需要额外添加昂贵的辅酶。相对于其它不对称还原制备方法，使用本发明方法制备所得的产物浓度高，不必额外添加昂贵的辅酶NAD+，并且具有产物光学纯度高、反应条件温和、对环境友好、操作简便、易于工业放大的优点。
【IPC分类】C12N15-70, C12N1-21, C12P17-18, C12N15-53, C12N9-04
【公开号】CN104830814
【申请号】CN201510257926
【发明人】罗煜, 丁时澄, 瞿旭东, 焦江华
【申请人】南京博优康远生物医药科技有限公司
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年5月19日