一种采用全细胞转化高效生产α-苯丙酮酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种采用全细胞转化高效生产a-苯丙酮酸的方法，属于发酵工程领 域。
【背景技术】
[0002] a_苯丙酮酸（PPA)有很多应用，可用来合成抗肿瘤药物的杂环化合物，可作为抗 氧化剂及促进伤口愈合。是合成D-苯丙氨酸的原材料，D-苯丙氨酸是手性药物中间体。 PPA还可用于制备苯乳酸，苯乳酸可作为抗菌物质。传统PPA生产采用化学法，化学法的主 要缺点是缺乏选择性，采用有毒的氰化物及金属铜，产率低，且污染环境。酶和全细胞生物 催化剂越来越多的用于工业化生产。
[0003] L-氨基酸脱氨酶（EC1. 4. 3. 2)催化L-氨基酸氧化脱氨基，生成相应a-酮酸和 氨，多为黄素蛋白，二聚体结构。Proteus mirabilis KCTC2566有两种L-氨基酸脱氨酶，一 种具有广泛的底物特异性，能够催化脂肪族和芳香族L-氨基酸，尤其对L-苯丙氨酸具有较 高催化活性；另一种具有底物限制性，只对碱性氨基酸具有催化活性，尤其是L-组氨酸。
[0004] 全细胞转化相比分离酶具有许多优势：易制备，成本低；更稳定，使用方便；无污 染，副产物少。之前的研宄中我们已经成功构建了大肠杆菌全细胞催化剂，并对大肠杆菌进 行改造，敲除了降解PPA的三种氨基酸脱氨酶，转化率39 %。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一种L-氨基酸脱氨酶突变体，是以核苷 酸序列如SEQIDNO. 1所示的基因编码的酶作为亲本改造得到，所述L-氨基酸脱氨酶突变 体是D165G/S179L/F263V/L336V或D165K/F263M/L336M或D165K或F263M或L336M。
[0006] 所述突变体可以通过易错PCR和/或定点突变获得。
[0007] 本发明要解决的第二个技术问题是提供含有所述L-氨基酸脱氨酶突变体的全细 胞催化剂，是将编码所述L-氨基酸脱氨酶突变体的基因转化大肠杆菌得到重组菌，所得重 组菌可用于高效转化L-苯丙氨酸生产PPA。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌是E.coliBL21(DE3)。
[0009] 本发明要解决的第三个技术问题是提供应用所述全细胞催化剂转化生产 a-苯丙酮酸的方法，将L-苯丙氨酸10-12g/L、全细胞催化剂1. 2-1. 5g/L，在20mM Tris-HCl(pH8. 0)中，于 36-37°C、200-220rpm转化 6h。
[0010] 所述全细胞催化剂是湿菌体。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述全细胞催化剂的获得，是将含有L-氨基酸脱氨 酶突变体的重组大肠杆菌按1-2%接种量接到1.8L发酵培养基中，搅拌转速、通气量和温 度分别为400rpm、1 ?Ovvm和28°C，当0D6QQ达到0? 6-0. 8，加入0? 4mMIPTG诱导L-氨基酸脱 氨酶表达。诱导5_7h后，8,OOOrpm低温离心10_15min，收集菌体，用20mMTris-HCl(pH8. 0) 缓冲液洗两遍菌体即得。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，发酵培养基：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。 各组分溶解后高压灭菌。冷却到60°C，再加100mL灭菌的17mmol/LKH2P〇dP72mmol/L K2HP04的溶液（2. 31g的KH孑04和12. 54g的K，04溶于水中，终体积为100mL，高压灭菌）。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，全细胞转化体系为：L-苯丙氨酸10g/L，全细胞催化 剂1. 2g/L，反应在20mMTris-HCl (pH8.0)中进行，37°C，200rpm转化6h。
[0014] 本发明的有益效果：本发明成功实现了L-氨基酸脱氨酶的改造，提高了利用大肠 杆菌重组细胞转化L-苯丙氨酸生产PPA的转化率。含有L-氨基酸脱氨酶突变体D165G/ S179L/F263V/L336V的重组菌全细胞转化L-苯丙氨酸生产PPA的转化率为81 %。含有L-氨 基酸脱氨酶突变体D165K/F263M/L336M的重组菌全细胞转化L-苯丙氨酸生产PPA的转化 率为100%。本发明建立的全细胞转化体系，解决了化学法合成PPA的步骤繁琐、得率低、污 染环境等问题及酶法转化生产PPA的转化率低的问题，实现了无污染、高产率、一步法生产 PPA，为后续工业化生产奠定了一定的理论基础。
【具体实施方式】
[0015] 材料与方法
[0016] 种子培养基：蛋白胨lg，酵母粉0.5g，NaCllg，自来水定容至100mL。
[0017] 发酵培养基：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各组分溶解后高压灭菌。冷 却到 60°C，再加 100mL灭菌的 17mmol/LKH2P04和 72mmol/LK2HP04的溶液。
[0018]PPA含量测定：将转化体系进行离心，取上清100yL，加入3mL三氯化铁，分光光度 计测定640nm的吸光度。
[0019] 实施例1易错PCR对L-氨基酸脱氨酶进行改造
[0020] 以P.mirabilisKCTC2566的基因组为模板，克隆得到编码L-氨基酸脱氨酶的基因 pma，连接载体pET_20b(+)，以所得重组质粒pET-pma为模板，MutazymeIIDNApolymerase 低保真酶扩增pma基因。PCR产物纯化、酶切后，与载体pET-20b(+)连接，构建重组质粒，转 化大肠杆菌BL21构建突变体文库。挑取氨苄抗性平板上生长的单菌落接种到LB，在96孔 板中37°C震荡过夜培养，接种到另一块96孔板的TB培养基中，IPTG诱导5h，测定PPA产 量。初筛后，PPA产量高的菌株摇瓶发酵复筛，进一步测试底物转化率，（底物转化率=转化 为PPA的底物浓度/初始底物浓度*100% )。转化率高的菌株，提取质粒，作为下一轮易错 PCR或定点饱和突变的模板。
[0021] 实施例2定点突变对L-氨基酸脱氨酶进行改造
[0022] 对实施例1得到的转化率高的突变体的突变位点逐个进行定点饱和突变。以实施 例1突变后的重组质粒为模板，Prime-STARHSDNApolymerase高保真酶及设计的突变引 物一步法扩增，Dpnl限制性内切酶消化模板DNA，然后磷酸化，连接为全质粒，转化大肠杆 菌BL21。
[0023] 两轮改造后，得到的单突变体中，PPA产量较高的突变体为：D165K，F263M，L336M。 将这几个突变位点组合在一起，构建复合突变体D165K/F263M/L336M。含野生型L-氨基酸 脱氨酶及各突变体的重组菌全细胞转化PPA的转化率如表1所示。
[0024]表1
[0025]
【主权项】
1. 一种L-氨基酸脱氨酶突变体，其特征在于，是以核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示 的基因编码的酶作为亲本改造得到，所述L-氨基酸脱氨酶突变体是D165G/S179L/F263V/ L336V 或 D165K/F263M/L336M 或 D165K 或 F263M 或 L336M。
2. 编码权利要求1所述突变体的基因。
3. 权利要求1所述L-氨基酸脱氨酶突变体在生产α -苯丙酮酸中的应用。
4. 含有权利要求1所述L-氨基酸脱氨酶突变体的全细胞催化剂，其特征在于，是将编 码所述L-氨基酸脱氨酶突变体的基因转化大肠杆菌得到重组菌，将重组菌作为全细胞催 化剂。
5. 根据权利要求4所述的全细胞催化剂，其特征在于，所述大肠杆菌是Ε. coli BL21(DE3) 〇
6. 应用权利要求4或5所述全细胞催化剂转化L-苯丙氨酸生产α -苯丙酮酸的方 法，其特征在于，将L-苯丙氨酸10-12g/L、全细胞催化剂I. 2-1. 5g/L，在pH 8. O的20mM Tris-HCl 中，于 36-37 °C、200-220rpm 转化 6h。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述全细胞催化剂是湿菌体。
8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述全细胞催化剂的获得，是将含有L-氨 基酸脱氨酶突变体的重组大肠杆菌按1-2%接种量接到1.8L发酵培养基中，搅拌转速、 通气量和温度分别为400rpm、l. Ovvm和28°C，当OD6tltl达到0. 6-0. 8,加入0. 4mM IPTG诱 导L-氨基酸脱氨酶表达；诱导5-7h后，8, OOOrpm低温离心l〇-15min，收集菌体，用20mM Tris-HCKpH 8.0)缓冲液洗两遍菌体即得。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，发酵培养基：蛋白胨12g，酵母提取物 24g，甘油4mL，各组分溶解后高压灭菌，冷却到60°C，再加 IOOmL灭菌的17mmol/L ΚΗ2Ρ0# 72mmol/L 1(2即04的溶液。
10. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，全细胞转化体系为：L-苯丙氨酸10g/L， 全细胞催化剂I. 2g/L，反应在pH 8. 0的20mM Tris-HCl中进行，37°C，200rpm转化6h。
【专利摘要】本发明公开了一种采用全细胞转化高效生产α-苯丙酮酸的方法，属于发酵工程领域。本发明对L-氨基酸脱氨酶进行了改造，获得活性提高的L-氨基酸脱氨酶突变体。以含有L-氨基酸脱氨酶突变体的重组菌全组细胞转化L-苯丙氨酸生产PPA，L-苯丙氨酸生产PPA的转化率显著提高。本发明建立的全细胞转化体系，解决了化学法合成PPA的步骤繁琐、得率低、污染环境等问题及酶法转化生产PPA的转化率低的问题，实现了无污染、高产率、一步法生产PPA，为后续工业化生产奠定了一定的理论基础。
【IPC分类】C12N9-06, C12P7-40, C12R1-19, C12N1-21, C12N15-53
【公开号】CN104830815
【申请号】CN201510295252
【发明人】陈坚, 刘龙, 李江华, 堵国成, 侯颖, 顾汉章, 徐堃
【申请人】江南大学, 江苏汉光生物工程有限公司
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年6月2日