一种液态或固态瘤胃功能菌剂的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物质资源化利用领域，涉及一种瘤胃功能菌剂的制备、保存及使用方法，特别是对瘤胃功能菌的驯化培养、瘤胃功能菌剂的制备保存及菌剂的使用，提供对纤维素类生物质高效分解，沼气发酵产量高的菌剂的应用方法，同时也可以用于其他有机固体废弃物处理。
【背景技术】
[0002]农作物秸杆主要以植物细胞壁为主，其主要成分为纤维素、半纤维素和木质素，约占生物质秸杆的70?80%，其中纤维素含量约为40%?55%、半纤维素含量约为10%?25%、木质素含量约为20%?30%。三种分子之间通过不同的结合力紧密的结合在一起，其中木质素与纤维素分子之间主要以氢键结合为主，而半纤维素与木质素之间除了氢键以夕卜，存在于半纤维素分子支链上的糖基与木质素分子之间的共价键联结成网络结构，其构成更加复杂，使得二者很难分离开。由于其复杂的化学结构导致了秸杆的难降解性。
[0003]近年，由于秸杆的不合理利用及不正确处理造成了农村环境污染问题，为了改善农村生态环境，提高农民生活质量，针对秸杆的处理技术也受到人们的关注，其中包括，秸杆作为工业原料、秸杆气化技术、秸杆液化技术、秸杆发酵制沼气技术等。但由于在秸杆厌氧发酵产沼气的过程中，大多数微生物对其降解能力低，并且存在产气速率慢、产气量低、启动时间长等问题。
[0004]反刍动物瘤胃中含有大量能够分泌各类纤维素酶的微生物，包括细菌、真菌、古细菌及原虫等。在反刍动物瘤胃内微生物之间相互协调、相互共生，构成一个稳定的动态的微生物区系，通过微生物间的协同作用将秸杆等纤维类物质高效降解转化成动物所需的营养物同时伴随甲烷气体的产生，是迄今为止被认为是降解转化秸杆等纤维素类物质效率最高的天然体系。因此，如果能够体外模拟瘤胃环境，驯化富集瘤胃微生物并将其保存，对于秸杆厌氧发酵技术提供高效的菌种来源，从而改善农村生态环境，并使生物质资源的到充分利用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为了解决当前用于纤维素类物质厌氧发酵产沼气技术中的复合微生物菌剂种类少、效率低的问题，从而提供一种具有高效降解纤维素类物质产沼气的瘤胃功能菌剂的制备、保存及使用方法。由于该瘤胃功能菌剂是由反刍动物瘤胃内容物经驯化、富集、纯化得到，其微生物组成丰富，在对纤维素等有机废物进行处理时，避免了单一一种或几种微生物处理的不彻底性，明显提高了厌氧发酵降解效率，降低处理成本并回收资源，其制备及保存方法简单、成本低，所以具有实用和推广价值。
[0006]本发明通过以下技术措施实现:
[0007]本发明的瘤胃功能菌剂的原始菌种来源于反刍动物瘤胃内容物，取出后迅速装入具有保温功能的充满惰性气体容器内，使其保持厌氧环境，作为瘤胃功能菌剂制备的原始菌种。
[0008]一种瘤胃功能菌剂的制备方法，步骤如下:
[0009](I)瘤胃功能菌剂的驯化、富集和纯化:将含有瘤胃菌的瘤胃内容物按照体积比为10?50%接种到厌氧发酵系统中，加入磷酸缓冲溶液调节pH为7.0-7.5，按照质量比为I?10%加入纤维素类有机质作为降解底物，在温度条件为35?42°C，搅拌速率为100?500转/分，驯化富集9?20天，得到瘤胃功能菌。
[0010](2)液态菌剂的制备:将步骤⑴得到的瘤胃功能菌压滤后，去除其中的固体物质，滤出的瘤胃功能菌液密封，并按照质量比为0.5%?4%加入甘油或海藻糖作为保护剂，保存于O?20°C环境中。
[0011](3)固态菌剂的制备:将步骤⑴得到的瘤胃功能菌压滤脱水后滤出的固体物质，其含水率为80%?85%，按照干重质量比为0.5%?4%添加甘油或海藻糖作为保护剂，在厌氧环境下，搅拌均匀后置于40°C?105°C条件下干燥，粉末状的瘤胃功能菌剂装袋密封，于O?20°C环境条件下保存。
[0012]本发明的瘤胃功能菌剂按照其状态不同可制备成固态或液态菌剂，其制备与保存方法如下:
[0013]本发明的瘤胃功能菌剂在实际使用中，由于其微生物种类丰富，适应性强，不仅可以用于厌氧发酵还可以用于生物质堆肥、有机垃圾的处理、秸杆还田生物预处理等。使用方法为:将瘤胃功能菌剂接种于以有机质废弃物为底物，总固体浓度为I %?10%的厌氧发酵体系中，固体菌剂按照质量比为0.5%?5%接种，液态菌剂按照体积比为5%?25%接种，厌氧体系中加入磷酸缓冲溶液，保证体系pH在7.0?7.5，温度为35?42°C条件进行厌氧发酵。经过48h后，微生物活性全部恢复，纤维素酶活性将达到最高。
[0014]本发明的特点:
[0015]1、该瘤胃功能菌剂能高效降解纤维素类生物质，该菌剂中的微生物可有效破坏纤维素结构，快速分解为糖和挥发性脂肪酸，进而高效转化为沼气；
[0016]2、本发明利用自主研发的驯化方法，加速菌种富集倍增速度，提高菌群活性，使菌剂在使用过程中扩增速度加快，缩短停留时间。
[0017]3、该瘤胃功能菌剂较原始瘤胃微生物比较，驯化后的菌剂其菌群种类及比例发生了明显的变化，使其具有高效降解纤维素类有机质的特点。
[0018](I)原瘤胃内容物中的微生物菌群中细菌主要为:瘤胃球菌属(Ruminococcus)所占比例约为5%、紫单胞菌科Proteiniphilum菌属约为1%、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)约为6%。
[0019]经过体外厌氧条件驯化后，主要细菌菌属变为:瘤胃球菌属(Ruminococcus)所占比例约为I %、紫单胞菌科Proteiniphilum菌属所占比例为18 %、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)约为 18%。
[0020](2)原瘤胃内容物中的微生物菌群中真菌主要为:曲霉属真菌(Aspergillus)所占比例约为22%、裸胞壳属真菌(Emericella)约为19%、青霉菌属真菌(Penicillium)约为8% ο
[0021]经过体外厌氧条件驯化后，主要真菌菌属变为:曲霉属真菌(Aspergillus)所占比例约为19%、裸胞壳属真菌(Emericella)约为16%、青霉菌属真菌(Penicillium)约为20%o
[0022](3)原瘤胃内容物中的微生物菌群中产甲烷菌主要为:甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)所占比例约为 93%、甲烧杆菌属(Methanobacterium)为 1%、古生菌菌属(Archaea_unclassified)约为
[0023]经过体外厌氧条件驯化后，主要产甲烷菌属变为:甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)所占比例约为 2%、甲烧杆菌属(Methanobacterium)约为 80%、古生菌菌属(Archaea_unclassified)约为 2%、甲烧八叠球菌属(Methanosarcina) 10%。
【具体实施方式】
[0024]下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。
[0025]实施例1
[0026](I)收集水稻秸杆，自然风干后，用剪刀剪成2?3cm秸杆段，再用粉碎机将水稻秸杆粉碎成粒径小于5mm的颗粒，氨化后作为降解底物备用。
[0027](2)有效容积为500ml的厌氧培养瓶，向其中分别加入上述氨化后水稻秸杆5g作为降解底物，按照液态菌剂体积比为20%接种，加入经过N2曝气I小时后pH为7的磷酸缓冲溶液至500ml，驱除溶液中残留的氧气，加盖密封后放入温度为38±2°C的恒温摇床中，转速调节至150转/分，进行瘤胃功能菌剂厌氧发酵水稻秸杆试验。每天检测厌氧发酵产生气体的成分组成，经过10天厌氧发酵，液态和固态瘤胃功能菌剂厌氧发酵瓶中所产生气体中甲烷含量均在57 %%以上，氢气含量小于3 %，12天后水稻秸杆的干物质降解效率为60.5 %，瘤胃功能菌剂的降解效果明显。
[0028]实施例2
[0029](I)收集有机生活垃圾，剔除其中无法降解的玻璃、石子等。用粉碎机粉碎成小于7mm的颗粒，作为瘤胃功能菌剂厌氧发酵的降解底物。
[0030](2)有效容积为4L的厌氧发酵罐中，加入粉碎成颗粒的生活垃圾80g作为降解底物，按照质量比为2 %接种固态瘤胃功能菌剂，加入经过N2曝气I小时后pH为7的磷酸缓冲溶液至4L，按照设定好的温度38 ± 2°C，转速200转/分钟，密封后，厌氧发酵6天后，开始连续厌氧发酵实验，水力停留时间为20天，每天检测厌氧发酵液中挥发性有机酸浓度和产生气体中的气体成分组成，当连续厌氧发酵10天后，产生气体成分中甲烷含量维持在59%%以上、氢气含量小于2%，且液相产物中挥发性有机酸浓度维持在1800mg/L以下，单位克重干物质的产气量可以达到240ml/g。
【主权项】
1.一种液态或固态瘤胃功能菌剂的制备方法，其特征在于，步骤如下: (1)瘤胃功能菌剂的驯化、富集和纯化:将含有瘤胃菌的瘤胃内容物按照体积比为10?50%接种到厌氧发酵系统中，加入磷酸缓冲溶液调节pH为7.0-7.5，按照质量比为I?10%加入纤维素类有机质作为降解底物，在温度条件为35?42°C，搅拌速率为100?500转/分，驯化富集9?20天，得到瘤胃功能菌； (2)液态菌剂的制备:将步骤(I)得到的瘤胃功能菌压滤后，去除其中的固体物质，滤出的瘤胃功能菌液密封，并按照质量比为0.5%?4%加入甘油或海藻糖作为保护剂，保存于O?20°C条件下； (3)固态菌剂的制备:将步骤(I)得到的瘤胃功能菌压滤脱水后滤出的固体物质，其含水率为80%?85%，按照干重质量比为0.5%?4%添加甘油或海藻糖作为保护剂，在厌氧环境下，搅拌均匀后置于40°C?105°C条件下干燥，粉末状的瘤胃功能菌剂装袋密封，保存于O?20°C环境条件下。
2.权利要求1所述的制备方法制备的液态或固态瘤胃功能菌剂的应用，其特征在于，液态或固态瘤胃功能菌剂用于厌氧发酵、生物质堆肥、有机垃圾的处理或秸杆还田生物预处理。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将液态或固态瘤胃功能菌剂接种于以有机质废弃物为底物，总固体浓度为1%?10%的厌氧发酵体系中，固体菌剂按照质量比为.0.5%?5%接种，液态菌剂按照体积比为5%?25%接种，厌氧体系中加入磷酸缓冲溶液，保证体系pH在7.0?7.5，温度为35?42°C条件进行厌氧发酵，反应48h后，微生物活性全部恢复，纤维素酶活性达到最高。
【专利摘要】本发明公开了一种高效分解纤维素类有机质废物产沼气的瘤胃功能菌剂的制备、保存及使用方法，该菌剂的微生物菌种来源于自反刍动物瘤胃内容物，取出后迅速装入具有保温功能充满惰性气体的容器内，作为原始菌种。厌氧环境下，以纤维素类有机质作为降解底物，瘤胃内容物为接种物，经过驯化、富集与纯化，得到具有高效纤维素降解能力与甲烷生成速率的微生物菌群，其操作条件为：反应温度为35～45℃，搅拌器转速为100～300转/分，底物浓度为1～10％，pH为6.2～7.5，停留时间为9～20天。该复合微生物菌剂活性恢复快、制作成本低、纤维素降解效率高、沼气产生速率快、单位克重产气量高、无二次污染问题，适用范围广泛。
【IPC分类】C12P5-02, C12N1-04, C12N1-00
【公开号】CN104845889
【申请号】CN201510190596
【发明人】杨凤林, 周铭, 徐晓晨, 靳文尧
【申请人】大连理工大学
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年4月21日