一种乳酸乳球菌及利用其同时生产乳酸链球菌素和乳酸片球菌素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，确切地说是一种乳酸乳球菌及利用其同时生产乳酸链球菌素和乳酸片球菌素的方法。
【背景技术】
[0002]细菌素是某些细菌产生的一种蛋白类抗菌物质，作为食品防腐剂具有高效、无毒、耐酸、耐高温、无残留、无抗药性等优点。其中从乳酸菌中分离的细菌素主要有乳酸链球菌素(Nisin)和乳酸片球菌素(Ped1cin)，由于它们较强的抗食源性致病菌和腐败菌活性而被广泛关注。
[0003]Nisin是由某些乳酸乳球菌产生的一种含34个氨基酸的多肽物质，对许多革兰氏阳性菌包括葡萄球菌、链球菌、芽孢杆菌属等有强烈抑制作用。Ni sin的热稳定性、耐酸、耐低温保藏，没有生长刺激作用及其对食物的色香味没有不良影响。Nisin是开发成功的一个例子，目前世界上包括我国在内已有50多个国家许可Nisin作为食品防腐剂。
[0004]Ped1cin是乳酸片球菌产生的具有抑菌活性的小分子多肽，属于II类细菌素，能有效抑制利斯特氏菌以及其它革兰氏阴性菌。乳酸片球菌素具有较宽的PH耐受性和对低温与高温的耐受性，并且乳酸片球菌素天然、安全、无毒副作用。Ped1cin可以单独用在食品防腐和医疗上，也可以与Nisin互相补充，增强抑菌效果，具有极高的使用价值和应用前景。
[0005]乳酸乳球菌是一类食品级微生物，无内毒素，可用现代发酵技术在廉价的培养基中进行工业规模的培养，此外，乳酸乳球菌具有分泌蛋白质的能力，使许多同源蛋白质可表面表达或分泌出胞外，是细菌素表达的好宿主菌，但乳酸乳球菌异源表达Ped1cin时，由于分泌系统不能有效识别Ped1cin原有的前导肽序列，导致不能将Ped1cin前体有效分泌出胞外得到活性Ped1cin。目前尚未见有报道乳酸乳球菌同时生产Nisin和Ped1cin。
【发明内容】
[0006]本发明提供一种乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) SZ325，并利用该乳酸乳球菌同时产两种细菌素乳酸链球菌素(Nisin)和乳酸片球菌素(Ped1cin)，以克服现有技术的上述不足，达到为Nisin与Ped1cin共表达提供新方法，提高菌株生产效率，Nisin与Ped1cin互相补充扩大抑菌谱的技术目的。
[0007]上述目的通过以下方案实现:
本发明提供的一种新的乳酸乳球菌菌株，是从合肥地区生牛奶中分离，分类命名为乳酸乳球菌{Lactococcus lactis) SZ325，菌种保藏号为CGMCC N0.10613，保藏日期为2015年3月11日，保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研宄所。该乳酸乳球菌能生产Nisin，并且对Ped1cin有天然抗性。
[0008]—种乳酸乳球菌，其特征在于:是从牛奶中分离得到的，其生产乳酸链球菌素Nisin,并且对乳酸片球菌素Ped1cin有天然抗性，命名为乳酸乳球菌SZ325，菌种保藏号为 CGMCC N0.10613。
[0009]所述的乳酸乳球菌中同时生产Nisin和Ped1cin的方法，其特征在于包括如下步骤:
(I)构建含有Nisin前导肽序列N与Ped1cin结构基因pedA的杂合基因N-pedA:
①人工合成一对基因特异性扩增引物:
pnisl:50 -AACGGCTCTGATTAAATTCTGAAGTTT-30 ；
pnis2:50 -CCATTACCGTAGTATTTGCGTGGTGATGCACCTGAATC-30 ；
此两个引物含有与Nisin自身启动子、前导肽基因两侧的两条链互补序列，引物pnis2的50端17个核苷酸序列与pedA序列互补；以菌株L3ctococcus lactis SZ325的DNA为模板，进行聚合酶链式反应PCR扩增含有启动子与Nisin前导肽基因片段；
②再人工合成一对基因特异性扩增引物:
ppedl -M -GGTGCATCACCACGCAAATACTACGGTAATGGG-30 ；pped2 -M -TTATGATGCCAGCTCAGCATAAT-30 ；
此两个引物含有与PedA基因两侧的两条链互补序列，引物ppedl的50端15个核苷酸序列与Nisin前导肽序列互补；以含有ped1cin操纵子的DNA为模板，PCR扩增pedA基因片段;
③将步骤①和②中获得的两扩增片段等量混合作为二次PCR模板，以pnisl、pped2为引物，扩增出含有启动子、Nisin前导肽与pedA的融合基因片段N-pedA ；
(2)在克隆的N-pedA基因两端引入酶切位点BWII，经纯化后用限制性内切酶BWII酶切，酶切产物与经过Bg7II酶切的载体质粒连接，再转化菌株Lactococcus IactisSZ325 ；
(3)菌株培养后，即使得Nisin与Ped1cin的共表达。
[0010]所述的一种乳酸乳球菌中同时生产Nisin和Ped1cin的方法，其特征在于，步骤
(3)菌株培养后，采用NisiruPed1cin特定抗体进行非竞争性间接酶联免疫吸附试验、N端氨基酸序列分析证实Nisin与Ped1cin的共表达。
[0011]本发明的有益效果为:本发明针对乳酸乳球菌异源表达Ped1cin时分泌系统不能有效识别Ped1cin原有的前导序列的问题，采用接头重叠延伸技术，进行二次PCR扩增出含有Nisin前导肽序列与Ped1cin结构基因的杂合基因片段，连接到载体质粒并转化产Nisin的乳酸乳球菌，菌株细胞自身的Nisin分泌系统即可以识别并分泌两种细菌素，细胞同时生产Nisin与Ped1cin。这为多细菌素共表达提供了一条崭新的途径。
[0012]经测定，本发明中乳酸乳球菌生产Nisin和Ped1cin的产量都达到原对照菌株95%以上，表明两种细菌素共表达未影响单一细菌素原有表达水平。乳酸乳球菌同时生产Nisin与Ped1cin，菌株生产效率高，而且Nisin与Ped1cin互相补充，扩大了抑菌谱。
【具体实施方式】
[0013]下面用实施例进一步描述本发明，有利于对本发明及其优点、效果更好的了解，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。
[0014]本发明使用的乳酸乳球菌菌株，是从合肥地区生牛奶中分离，命名为乳酸乳球菌{Lactococcus lactis) SZ325，菌种保藏号为 CGMCC N0.10613，保藏日期为 2015 年 3 月 11日，保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研宄所。该乳酸乳球菌能生产乳酸链球菌素(Nisin)，并且对乳酸片球菌素(Ped1cin)有天然抗性。
[0015]实施例:
本实施例乳酸乳球菌同时产Nisin和Ped1cin的方法，包括通过二次PCR扩增出含有启动子与Nisin前导基因片段、连接载体质粒和转化乳酸乳球菌。本发明的【具体实施方式】如下:
(I)构建含有Nisin前导肽序列(N)与Ped1cin结构基因(pedA)的杂合基因N-pedA:
①人工合成一对基因特异性扩增引物:
pnisl:50 -AACGGCTCTGATTAAATTCTGAAGTTT-30 ；
pnis2:50 -CCATTACCGTAGTATTTGCGTGGTGATGCACCTGAATC-30 ；
此两个引物含有与Nisin自身启动子、前导肽基因两侧的两条链互补序列，引物pnis2的50端17个核苷酸序列与pedA序列互补；以菌株lactococcus lactis SZ325的DNA为模板，进行聚合酶链式反应(PCR)扩增含有启动子与Nisin前导肽基因片段。
[0016]②再人工合成一对基因特异性扩增引物:
ppedl -M -GGTGCATCACCACGCAAATACTACGGTAATGGG-30 ；pped2 -M -TTATGATGCCAGCTCAGCATAAT-30 ；
此两个引物含有与PedA基因两侧的两条链互补序列，引物ppedl的50端15个核苷酸序列与Nisin前导肽序列互补；以含有ped1cin操纵子的DNA为模板，PCR扩增pedA基因片段。
[0017]③将步骤①和②中获得的两扩增片段等量混合作为二次PCR模板，以pnisl、pped2为引物，扩增出含有启动子、Nisin前导肽与pedA的融合基因片段N-pedA。
[0018](2)表达质粒的构建:
①在克隆的N-pedA基因两端引入BWII酶切位点，经纯化后用限制性内切酶BWII酶切；
②将载体质粒用限制性内切酶BWII酶切；
③步骤①和②的酶切产物用T4-DNA连接酶连接；
④酶连产物转化大肠杆菌，在固体抗性培养基中培养；
⑤筛选阳性菌落，并提取质粒；
⑥酶切质粒，并进行电泳鉴定目标条带大小正确。
[0019](3)表达质粒转化乳酸乳球菌Lactococcus lactis SZ325。
[0020](4)菌株培养后，采用NisiruPed1cin特定抗体进行非竞争性间接酶联免疫吸附试验、N端氨基酸序列分析证实Nisin与Ped1cin的共表达。采用抑菌圈法，以Nisin与Ped1cin的特异指示菌溶壁微球菌和利斯特氏菌做抑菌实验，菌株培养液中活性Nisin与Ped1cin的产量均可达到原对照菌株95%以上。
【主权项】
1.一种乳酸乳球菌，其特征在于:是从牛奶中分离得到的，其生产乳酸链球菌素Nisin,并且对乳酸片球菌素Ped1cin有天然抗性，命名为乳酸乳球菌SZ325，菌种保藏号为 CGMCC N0.10613。
2.一种利用权利要求1所述的乳酸乳球菌同时生产乳酸链球菌素和乳酸片球菌素的方法，其特征在于包括如下步骤: (I)构建含有Nisin前导肽序列N与Ped1cin结构基因pedA的杂合基因N-pedA: ①人工合成一对基因特异性扩增引物:pnisl:50 -AACGGCTCTGATTAAATTCTGAAGTTT-30 ；pnis2:50 -CCATTACCGTAGTATTTGCGTGGTGATGCACCTGAATC-30 ； 此两个引物含有与Nisin自身启动子、前导肽基因两侧的两条链互补序列，引物pnis2的50端17个核苷酸序列与pedA序列互补；以菌株L3ctococcus lactis SZ325的DNA为模板，进行聚合酶链式反应PCR扩增含有启动子与Nisin前导肽基因片段； ②再人工合成一对基因特异性扩增引物:ppedl -M -GGTGCATCACCACGCAAATACTACGGTAATGGG-30 ；pped2 -M -TTATGATGCCAGCTCAGCATAAT-30 ； 此两个引物含有与PedA基因两侧的两条链互补序列，引物ppedl的50端15个核苷酸序列与Nisin前导肽序列互补；以含有ped1cin操纵子的DNA为模板，PCR扩增pedA基因片段; ③将步骤①和②中获得的两扩增片段等量混合作为二次PCR模板，以pnisl、pped2为引物，扩增出含有启动子、Nisin前导肽与pedA的融合基因片段N-pedA ； (2)在克隆的N-pedA基因两端引入酶切位点BWII，经纯化后用限制性内切酶BWII酶切，酶切产物与经过Bg7II酶切的载体质粒连接，再转化菌株Lactococcus IactisSZ325 ； (3)菌株培养后，即使得Nisin与Ped1cin的共表达。
3.根据权利要求2所述的利用一种乳酸乳球菌同时生产乳酸链球菌素和乳酸片球菌素的方法，其特征在于，步骤(3)菌株培养后，采用NisiruPed1cin特定抗体进行非竞争性间接酶联免疫吸附试验、N端氨基酸序列分析证实Nisin与Ped1cin的共表达。
【专利摘要】本发明提供了一种乳酸乳球菌及利用其同时生产乳酸链球菌素Nisin和乳酸片球菌素Pediocin的方法。采用接头重叠延伸技术，进行二次PCR扩增出含有Nisin前导肽序列与Pediocin结构基因的杂合基因片段N-pedA，将N-pedA克隆到载体质粒中，再转化菌种保藏号为CGMCC No.10613的Nisin产生菌乳酸乳球菌Lactococcus lactis SZ325，该菌株即可以同时生产Nisin和Pediocin，测定结果表明两种细菌素产量均达到原对照菌株95%以上。本发明为Nisin与Pediocin共表达提供了新方法，提高了菌株生产效率，而且Nisin与Pediocin互相补充，扩大了抑菌谱。CGMCC No.1061320150311
【IPC分类】C12N1-21, C12R1-46, C12N15-74, C07K14-315
【公开号】CN104845925
【申请号】CN201510265307
【发明人】宋建民, 张琴, 王德海, 宛荣生
【申请人】安徽民祯生物工程有限公司
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年5月22日