具有凝血酶响应性溶栓能力的水凝胶材料以及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医用高分子材料和高分子化学领域，具体涉及一种具有响应性溶栓功能的材料以及其制备方法。
【背景技术】
[0002]材料引发血栓的生成是导致人体植入血液接触器件应用失败的主要原因之一，目前解决该问题的最主要途径是在材料中引入抗血栓活性分子，如肝素和纤溶酶原等，进而实现材料对凝血反应的抑制或对初生血栓的溶解。然而，抗血栓活性分子的长期暴露必然会引发血液系统的功能紊乱，伴随严重的并发症，如组织出血等。理想的抗血栓活性材料应具有血栓响应性，即只在凝血反应发生时启动抗血栓机制，这也更符合人体自身功能调节机制的运作模式。
[0003]血栓的生成伴随显著的凝血酶的产生。凝血酶作为凝血级联反应中第II因子的激活形式，是不同凝血途径共有的产物，其对纤维蛋白原的酶解作用促使纤维蛋白聚集体(初级血栓)的产生。此外凝血酶还会反馈激活凝血级联过程上游的凝血因子，造成凝血反应的自加速。总之，凝血酶的产生是血栓形成的重要特征事件。
[0004]一些抗血栓药物及药物载体的设计中引入了凝血酶响应性能，使药物能够在血栓生成的部位发挥作用。例如，s.Absar等人在溶栓剂表面通过凝血酶底物多肽接枝上白蛋白，从而暂时掩蔽其纤溶活性，而在凝血酶产生的部位能够通过多肽的酶解而释放出活性溶检剂(Journal of Controlled Release, 177, 42-50，2014)。又例如 M.A.Nakatsuka等人利用凝血酶的核酸适配体为交联点制备了微气泡作为凝血酶响应性超声造影剂(B1materials, 34，9559-9565，2013)。
【发明内容】
[0005]本发明克服了现有技术的不足，将凝血酶响应性能运用于抗血栓材料的设计。由于凝血酶的产生即伴随初级血栓的生成，因此，我们将凝血酶响应性与溶栓活性相结合，制备了具有血栓响应性溶栓功能的水凝胶材料。
[0006]为达到上述目的，本发明采用的一种技术方案为:一种具有凝血酶响应性溶栓能力的水凝胶材料，其特征在于:以有机分子作为单体，以凝血酶底物多肽作为交联剂，通过聚合形成水凝胶的同时包裹溶栓活性分子，该溶栓活性分子在凝血酶对交联剂化学键的切断作用下能够被快速释放。
[0007]本发明一个较佳实施例中，所述交联点的切断速率与凝血酶的浓度正相关，所述单体与所述交联剂的物质的量之比与所述交联点的切断速率正相关。
[0008]本发明一个较佳实施例中，所述有机分子单体可以为水溶性乙烯基分子单体。
[0009]本发明一个较佳实施例中，所述交联剂为两端修饰双键的凝血酶底物多肽。
[0010]本发明一个较佳实施例中，所述凝血酶底物多肽的序列为甲基丙烯酸-Gly-dPhe-Pro-Arg-Gly-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Lys (甲基丙稀酸) 本发明一个较佳实施例中，所述溶栓活性分子为可以为组织型纤溶酶原激活剂。
[0011]本发明一个较佳实施例中，自由基聚合的反应条件为pH=6~8、温度范围0~37°C。
[0012]本发明一个较佳实施例中，自由基聚合的反应条件为pH=7.4、温度范围25°C。
[0013]本发明采用的另一种技术方案为:一种制备如水凝胶材料的方法，其特征在于，包括以下步骤:将水溶性乙烯基单体溶液、两端修饰双键的凝血酶底物多肽溶液、溶栓活性分子以及引发剂体系混合，进行自由基聚合反应。
[0014]本发明一个较佳实施例中，所述水溶性乙烯基单体溶液具体为丙烯酰胺溶液。
[0015]本发明一个较佳实施例中，所述引发剂体系是水溶性氧化还原体系，所述氧化剂为过硫酸盐，所述还原剂为脂肪胺或脂肪二胺。
[0016]本发明一个较佳实施例中，所述溶液、所述引发剂和所述活性分子溶液均用磷酸盐缓冲液配制。
[0017]本发明一个较佳实施例中，所述溶栓活性分子为可以为组织型纤溶酶原激活剂。
[0018]本发明一个较佳实施例中，所述氧化还原体系中，所述氧化剂为过硫酸铵，所述还原剂为N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺。
[0019]本发明一个较佳实施例中，所述自由基聚合反应结束后还可以进行以下操作:将反应所得水凝胶通过磷酸盐缓冲液清洗一段时间，即得。
【附图说明】
[0020]图1为水凝胶材料在有凝血酶和无凝血酶存在的情况下的t-PA释放曲线；
图2为水凝胶材料在有凝血酶和无凝血酶存在的情况下的溶栓能力曲线；
图3不同交联度的水凝胶在20U/mL浓度凝血酶中的溶栓活性分子释放速率曲线；
图4水凝胶在不同浓度凝血酶中的溶栓活性分子释放速率曲线；
图5溶栓活性分子释放平均速率与凝血酶浓度的关系曲线。
【具体实施方式】
[0021]现在结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
[0022]本发明所要解决的技术问题是:提供一种具有凝血酶响应性溶栓能力的水凝胶材料及其制备方法。所述水凝胶能够在凝血酶存在的情况下即血栓生成时发生降解并释放溶栓活性分子，实现对血栓的溶解。
[0023]如图1-5所示:
凝血酶在体内导致凝血的机理就是切断可溶性的纤维蛋白原(即Fg蛋白)的Arg-Gly键(即精氨酸和甘氨酸之间的键)将之转化不溶性的纤维蛋白。
[0024]凝血酶切断交联点(化学键)的作用机理为:本发明所用的多肽序列为甲基丙烯-Gly-dPhe-Pro-Arg-Gly-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Lys (甲基丙稀酸)，该多肽中间的 Arg-Gly 键可以被凝血酶酶切，所以当凝血酶存在时，交联剂会发生断裂，交联结构被破坏，进而释放溶栓活性分子。
[0025]水凝胶交联度的调节:交联度通过改变加入交联剂的量来调节(即交联剂在所配制溶液中的浓度)，交联剂量越多交联度越大，交联度越大的凝胶蛋白释放速率越慢。
[0026]凝血酶浓度越高，溶栓活性分子从水凝胶中的释放速率越快。
[0027]本发明按下述方案实现其功能:
将乙烯基单体、凝血酶底物多肽交联剂、溶栓活性分子、催化体系混合，经过自由基聚合反应，得到包裹有溶栓活性分子的水凝胶。该水凝胶的交联剂一一凝血酶底物多肽，多肽是长链状的，其化学键能够在凝血酶的作用下发生断裂，从而使水凝胶降解并释放出溶栓活性分子。
[0028]与现有技术相比，本发明具有以下突出的特点:
1.以凝血酶底物多肽为交联剂，通过自由基聚合制备水凝胶，水凝胶在凝血酶的作用下发生降解。
[0029]2.水凝胶包载溶栓活性分子，该分子只在凝血酶的作用下得以释放，进而溶解血栓。
[0030]本发明提供的制备凝血酶响应性溶栓材料的方法，是以水溶性乙烯基分子为单体，以两端修饰双键的凝血酶底物多肽为交联剂，通过自由基聚合形成水凝胶。
[0031]下面结合具体实例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。
[0032]实施例1
将25 μ L浓度为150 mg/mL的丙烯酰胺溶液、5 μ L浓度为50mg/mL的多肽(序列为甲基丙稀酸-Gly-dPhe-Pro-Arg-Gly-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Lys (甲基丙稀酸))溶液、2.5 μ L浓度为I mg/mL的组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)溶液、0.5 μ L N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺(TEMED)，以及2 μ L浓度为500 mg/mL的过硫酸铵溶液(溶液均用PH=7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)配制)混合，于25°C下进行自由基聚合反应，20 min后将所得凝胶浸泡到PBS中清洗3h，即得到有凝血酶响应性溶栓功能的水凝胶材料。
[0033]通过同位素标记法测试了水凝胶在凝血酶的作用下释放t-PA的过程。如图1所示，t-PA只有在凝血酶存在的情况下可以显著释放，且释放速率可以通过改变交联度来调节。将释放后的溶液用于血浆血栓溶解测试，如图2所示，只有在凝血酶作用下发生降解并释放出t-PA的水凝胶能够在血栓生成后再将其溶解。
[0034]其中图3中，水凝胶的交联度大小关系为:A>B>C>D;
图5是在图4的数据基础上得出的。
[0035]以上依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定技术性范围。
【主权项】
1.一种具有凝血酶响应性溶栓能力的水凝胶材料，其特征在于:以有机分子作为单体，以凝血酶底物多肽作为交联剂，通过聚合反应形成水凝胶的同时包裹溶栓活性分子，该溶栓活性分子在凝血酶对交联剂化学键的切断作用下能够被快速释放。
2.根据权利要求1所述的水凝胶材料，其特征在于:所述交联点的切断速率与凝血酶的浓度正相关，所述单体与所述交联剂的物质的量之比与所述交联点的切断速率正相关。
3.根据权利要求1或2所述的水凝胶材料，其特征在于:所述有机分子单体可以为水溶性乙烯基分子单体。
4.根据权利要求1或2所述的水凝胶材料，其特征在于:所述交联剂为两端修饰双键的凝血酶底物多肽。
5.根据权利要求1或2所述的水凝胶材料，其特征在于:所述溶栓活性分子为可以为组织型纤溶酶原激活剂。
6.根据权利要求1所述的水凝胶材料，其特征在于:所述聚合反应为自由基聚合反应，所述自由基聚合的反应条件为pH=6~8、温度范围0~37°C。
7.一种制备如权利要求1所述水凝胶材料的方法，其特征在于，包括以下步骤:将水溶性乙烯基单体溶液、两端修饰双键的凝血酶底物多肽溶液、溶栓活性分子以及引发剂体系混合，进行自由基聚合反应。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于:所述引发剂体系是水溶性氧化还原体系，所述氧化剂为过硫酸盐，所述还原剂为脂肪胺或脂肪二胺。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于:所述溶液、所述引发剂和所述活性分子溶液均用磷酸盐缓冲液配制。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于:所述自由基聚合反应结束后还可以进行以下操作:将反应所得水凝胶通过磷酸盐缓冲液清洗一段时间，即得。
【专利摘要】本发明公开了一种具有凝血酶响应性溶栓能力的水凝胶材料以及制备方法，本发明具有凝血酶响应性溶栓能力的水凝胶材料是由凝血酶底物多肽作为交联剂，通过自由基聚合反应形成水凝胶的同时包裹溶栓活性分子，该溶栓分子只在凝血酶的作用下可以显著释放并发挥溶栓功能。本材料具有凝血酶响应性（血栓响应性）的溶栓能力，避免了传统溶栓材料由于活性分子的长期暴露而引发一系列并发症这一弊端，在人体植入血液接触材料方面有应用前景。
【IPC分类】C08J3-075, A61L31-16, C08F220-56, A61L31-06, A61L33-18, A61L31-14
【公开号】CN104861177
【申请号】CN201510204456
【发明人】陈红, 杜慧, 李丹
【申请人】苏州大学
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年4月27日