一种与α-鹅膏毒肽特异结合的核酸适配体及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种与α -鹅膏毒肽特异结合的核酸适配体及应用，属于生物医学技 术领域。
【背景技术】
[0002] 核酸适配体是一类能与靶分子特异性、高亲和力结合的寡核苷酸分子（DNA或 RNA)，可通过SELEX技术，从特定的寡核苷酸库中筛选得到。由于其具有靶分子范围广、分 子质量小、免疫原性低、易于化学合成、改造和标记等优点，核酸适配体在临床诊断鉴定和 疾病治疗等领域中具有重要的应用价值。
[0003] 鹅膏菌毒素（amanitin)是从毒蘑菇中分离出来的一种多肽类物质，其中以α-鹅 膏毒肽的毒性最强（α-amanitin)。人若误食含有α-鹅膏毒肽的鹅膏菌（Amanita)后， 轻者可产生腹泻、腹痛、呕吐，重者可出现幻觉、昏迷等多种症状，致死率较高。α -鹅膏毒 肽是从鹅膏菌中分离出来的一种八肽化合物，它是RNA聚合酶II的专一性抑制剂，能抑制 真核细胞RNA聚合酶II的活性，从而阻碍mRNA转录和蛋白质的合成，这也是引起鹅膏毒 素中毒，导致死亡的主要因素。因此，利用SELEX技术筛选α-鹅膏毒肽的特异性核酸适配 体，进而及时、快速检测出食用野生菌中是否含有鹅膏毒素，对于降低误食蘑菇中毒及诊断 治疗具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种与α -鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体，其核苷酸序 列如SEQ ID NO :1所示；该核酸适配体为单链DNA，由84个核苷酸组成，拓扑学结构为直链 状；预测的二级结构具有突出的环和茎，存在G-四链体结构，吉布斯自由能DG=-14. 901。
[0005] 本发明另一目的是将与α -鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体应用在识别α -鹅 膏毒肽或在制备检测α-鹅膏毒肽的试剂盒中。
[0006] 本发明的技术方案如下： 1、 α -鹅膏毒肽特异性核酸适配体（Ε06)的筛选、克隆、分离和测序 采用SELEX技术筛选出能够与α -鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体群体，设计引 物进行PCR扩增、克隆、分离和测序。利用酶联寡核苷酸吸附试验（ELONA)进行验证，得 到适配体Ε06,它能够高亲和力高特异性的结合α-鹅膏毒肽。配体接头引物序列为： Aptamer Fw: GACATATTCAGTCTGACAGC;反向互补序列：CGCTGTCAGACTGAATATGTC;Aptamer Rv: GCTAGACGATATTCGTCCATC，反向互补序列：GATGGACGAATATCGTCTAGC。所获阳性单克隆进 行核苷酸序列测定，测序结果表明与α-鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体（E06)由84个 核苷酸组成，其序列（5'端至3'端）为： tgacatattc agtctgacag cgtactgtcg actattgggc ggtatgggga caacattgcg ttgatggacg aatatcgtct agca ； 2、 核酸适配体（E06)单链DNA二级结构表征 使用 MFOLD 软件（http://mfold. rna. albany. edu/q=mfold/DNA_Folding-Form)对与 α -鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体E06单链DNA分子进行二级结构预测，结果表明，其 二级结构具有突出的环和茎，存在G-四链体结构，吉布斯自由能DG=-14. 901，显示该结构 具有较高的稳定性；其二级结构如下：
【主权项】
1. 一种与a -鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO :1 所示。
2. 根据权利要求1所述核酸适配体，其特征在于：其二级结构具有突出的环和茎，存在 G-四链体结构，吉布斯自由能DG=-14. 901。
3. 权利要求1所述核酸适配体在识别a-鹅膏毒肽或在制备检测a-鹅膏毒肽的试剂 盒中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种利用selex技术得到的能够高亲和力高特异性结合α-鹅膏毒肽的核酸适配体，该核酸适配体是一种单链DNA，由84个核苷酸组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；其二级结构含有突出的环和茎，存在G-四链体结构，吉布斯自由能DG=-14.901；该核酸适配体通过酶联寡核苷酸吸附试验能特异性检测到α-鹅膏毒肽。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-113
【公开号】CN104862314
【申请号】CN201510234400
【发明人】韩芹芹, 乔璞, 宋玉竹, 张金阳, 陈强
【申请人】昆明理工大学
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年5月11日