一种用于高通量核酸测序的乳液pcr体系的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于高通量核酸测序的乳液PCR体系。
【背景技术】
[0002]焦磷酸测序技术(pyrosequencing)是一种新型的酶联级联测序技术，焦磷酸测序法适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与SangerDNA测序法相媲美，而速度却大大的提高。焦磷酸测序技术产品具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行单核苷酸多态性(single nucle一otidepotymorphisms, SNPs)研宄和临床检验提供了非常理想的技术操作平台。
[0003]该技术进行改进后可以满足上百个核苷酸序列的测序工作，这样该技术又可以满足对重要微生物的鉴定与分型，特定DNA片段的突变检测和克隆鉴定等方面的应用。原理焦磷酸测序技术是由几种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。
[0004]现有的焦磷酸测序技术都是基于乳液PCR (emuls1n PCR)的测序模板制备技术。乳液PCR主要通过将水相PCR溶液(包含有引物，聚合酶，核苷酸和待扩增DNA)与油混合，创建一种微小的悬浮水滴乳液。每个液滴都作为其自身PCR的“反应器”，从而创造了平行反应中的多个独立反应。目前市面上的很多数字PCR仪器能进行这种实验，其优点之一在于这样大量的独立反应能令产物只见到交叉污染缩小到最少，并且更重要的是，乳化PCR方法能将单调乏味的实验进化成高通量的扩大实验。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是一种用于高通量核酸测序的乳液PCR体系，所述PCR体系为微乳液体系，包括水相、油相、引发剂、保护剂、表面活性剂与助表面活性剂。
[0006]所述水相与油相的体积比为4:9-4: 7，优选为8:17。
[0007]所述油相为DC5225C、PGFE, DC193、DC556和矿物油中的I种或几种，优选为DC5225C、DC193 和 DC556。
[0008]所述引发剂为过硫酸钠，占体系的重量比为0.03-0.1%。
[0009]所述保护剂为BSA和人血清蛋白中的一种或两种，优选为BSA。
[0010]所述表面活性剂为span80、TritonX-100、tween80、tween60 和 tween20 中的一种或几种，优选为span80、TritonX-100、tween80和tween60 ;在微乳液制备时，span80、tween80、tween60 和 tween20 溶于油相，TritonX-100 溶于水相。
[0011]所述表面活性剂占体系的体积比为span80 2.5-5%, TritonX-100 0.4-1.0%，tween80 0.2-0.5%，tween60 0.3-0.5%、tween20 0.2-0.8% ;优选为 span80 2.5-3.5%，TritonX-100 0.7-0.9%, tween80 0.3-0.4%, tween60 0.4_0.5%和 tween20 0.4-0.7%o
[0012]所述助表面活性剂为聚乙二醇、山梨醇和丙三醇中的一种或几种。
[0013]所述水相中包括emPCR助剂、扩增液、引物、DNA聚合酶、dNTP、PPiase (肽脯氨酰顺反异构酶)、MgCl2和水。
[0014]所述emPCR助剂包括betaine (甜菜碱)、D-(+) trehalose (右旋海藻糖)、L-carnitine (左旋肉碱)、NP_40 (乙基苯基聚乙二醇)、DTT (二硫苏糖醇)、formamide(甲酰胺)和DMSO( 二甲基亚砜)中的一种或几种，优选为betaine、D-(+) trehalose、L-carnitine、NP-40、DTT 和 formamide。
[0015]所述水为nuclease-free water ;所有试剂采用分析纯及其以上纯度。
[0016]本发明提供的emPCR体系优化了核酸测序的体系环境，试剂的选取增加了微乳液体系的稳定性，油水比例适宜，使测序结果更精确、均一和稳定。该方案制备的微乳液体系热稳定性好，微球在液滴中分布均勾，单克隆比例高。本发明选取的表面活性剂和助剂的增溶度大，成核效率高，非常有利于提高测序的反应速率。
【具体实施方式】
[0017]实施例1
(I)油相，混合 DC5225C 500 yL、DC193 550 μ L 和 DC556 1200 μ L0
[0018](2)水相，加入
1x扩增液 100 μ L ΙΟμΜ 引物 I 120yL 25 μ M 引物 2 40 μ L DNA聚合酶 80 μ L dNTP120 μ L
PPiase2 μ L
MgCl2(IM) 30 μ L emPCR 助剂 350 μ L BSA12 μ L
双蒸无菌水余量总计100yL
其中，emPCR 助剂为 Betaine 0.4M，D- (+) trehalose 0.5M，L-carnitine 0.1M，NP-400.2%，DTT 2.5mM, DMSO 1% (其中的百分含量为体积比，以下实施例同)。
[0019](3)按占体系的体积比，将聚乙二醇、span80 2.5%, tween80 0.4% 和 tween200.7%溶于油相，TritonX-100 0.4%溶于水相，加入过硫酸钠0.03%，混合，乳化。
[0020]实施例2
(1)油相，混合PGFE 450 μ L 和 DC556 1300 μ L
(2)水相，加入
1x扩增液 100 μ L ΙΟμΜ 引物 I 120yL 25 μ M 引物 2 40 μ L DNA聚合酶 80 μ L dNTP120 μ L
PPiase2 μ L
MgCl2(IM) 30 μ L emPCR 助剂 350 μ L 人血清蛋白 1yL 双蒸无菌水余量总计100yL
其中，emPCR 助剂为 Betaine 1.0M, D- (+) trehalose 0.2M，L-carnitine 0.4M，NP-400.6%，DTT ImM，DMSO 2.5%。
[0021](3)将丙三醇 0.6%。、span80 3.5%，tween80 0.3% 和 tween60 0.4% 溶于油相，TritonX-100 0.7%溶于水相，加入过硫酸钠0.1%，混合，乳化。
[0022]实施例3
(I)配制油相，混合 DC5225C 300 μ L,PGFE 200 yL、DC193 800 yL、DC556 300 μ L 和矿物油400 μ Lo
[0023](2)配制水相，加入
1x扩增液 100 μ L ΙΟμΜ 引物 I 120yL 25 μ M 引物 2 40 μ L DNA聚合酶 80 μ L dNTP120 μ L
PPiase2 μ L
MgCl2(IM) 30 μ L emPCR 助剂 350 μ L BSA5 μ L
人血清蛋白5yL
双蒸无菌水余量总计100yL
其中，emPCR 助剂为 Betaine 0.45M，D- (+)trehalose 0.4M，L-carnitine 0.15M，NP-40 0.3%，DTT 2.3mM，formamide 0.1%，DMSO 2.3%。
[0024](3)按占体系的体积比，将山梨醇 0.5%0、span80 5%，tween80 0.2%、tween60 0.3%和tween20 0.2%溶于油相，TritonX-100 0.9%溶于水相，混合，乳化。
[0025]实施例4
(I)油相，混合 DC5225C 525 μ L、PGFE 400 yL、DC193 600 μ L 和 DC556 600 μ L。
[0026](2)水相，加入
1x扩增液 100 μ L ΙΟμΜ 引物 I 120yL 25 μ M 引物 2 40 μ L DNA聚合酶 80 μ L dNTP120 μ L
PPiase2 μ L
MgCl2(IM) 30 μ L emPCR 助剂 350 μ L BSA10 μ L
双蒸无菌水余量总计100yL
其中，emPCR 助剂为 Betaine 0.90M，L-carnitine 0.35M，NP-40 0.5%，formamide0.2%0
[0027](3)按占体系的体积比，将聚乙二醇(λ 2%。、丙三醇(λ 3%。、tween80 (λ 4%和tween20 0.8%溶于油相，TritonX-100 1.0%溶于水相，加入过硫酸钠0.065%，混合，乳化。
[0028]实施例5
(I)油相，量取矿物油2125 μ L0
[0029](2)水相，加入
1x扩增液 100 μ L ΙΟμΜ 引物 I 120yL 25 μ M 引物 2 40 μ L DNA聚合酶 80 μ L dNTP120 μ L
PPiase2 μ L
MgCl2(IM) 30 μ L emPCR 助剂 350 μ L BSA10 yL
双蒸无菌水余量总计100yL
其中，emPCR 助剂为 Betaine IM0
[0030](3)按占体系的体积比，将聚乙二醇、山梨醇、丙三醇、span80 5%和tween60 0.5%溶于油相，将油相和水相混合，加入过硫酸钠0.08%，乳化。
[0031]上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。
【主权项】
1.一种用于高通量核酸测序的乳液PCR体系，其特征在于，所述PCR体系为乳液体系，包括水相、油相、引发剂、保护剂、表面活性剂与助表面活性剂。2.如权利要求1所述的用于高通量核酸测序的乳液PCR体系，其特征在于，所述水相与油相的体积比为4:9-4:7，优选为8:17。3.如权利要求1所述的用于高通量核酸测序的乳液PCR体系，其特征在于，所述油相为DC5225C、PGFE、DC193、DC556 和矿物油中的 I 种或几种，优选为 DC5225C、DC193 和 DC556。4.如权利要求1所述的用于高通量核酸测序的乳液PCR体系，其特征在于，所述引发剂为过硫酸钠。5.如权利要求1所述的用于高通量核酸测序的乳液PCR体系，其特征在于，所述保护剂为BSA和人血清蛋白中的一种或两种，优选为BSA。6.如权利要求1所述的用于高通量核酸测序的乳液PCR体系，其特征在于，所述表面活性剂为 span80、TritonX-lOO、tween80、tween60 和 tween20 中的一种或几种，优选为span80、TritonX-100、tween80 和 tween60 ;在微乳液制备时，span80、tween80、tween60 和tween20溶于油相，TritonX-1OO溶于水相。7.如权利要求1所述的用于高通量核酸测序的乳液PCR体系，其特征在于，所述表面活性剂占体系的比例为 span80 2.5-5%, TritonX-1OO 0.4-1.0%, tween80 0.2-0.5%, tween600.3-0.5%、tween20 0.2-0.8% ;优选为 span80 2.5-3.5%，TritonX-1OO 0.7-0.9%，tween800.3-0.4%，tween60 0.4-0.5% 和 tween20 0.4-0.7%。8.如权利要求1所述的用于高通量核酸测序的乳液PCR体系，其特征在于，所述助表面活性剂为聚乙二醇、山梨醇和丙三醇中的一种或几种。9.如权利要求1所述的用于高通量核酸测序的乳液PCR体系，其特征在于，所述水相中包括emPCR助剂、扩增液、引物、DNA聚合酶、dNTP、PPiase, MgCl2和水。10.如权利要求9所述的用于高通量核酸测序的乳液PCR体系，其特征在于，所述emPCR 助剂包括 betaine、D_ (+) trehalose、L-carnitine、NP_40、DTT、formamide 和 DMSO 中的一种或几种，优选为 betaine、D- (+) trehalose、L-carnitine、NP-40、DTT 和 formamide。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于高通量核酸测序的乳液PCR体系。该乳液PCR体系包括水相、油相、引发剂、保护剂、表面活性剂与助表面活性剂。本发明提供的乳液PCR体系，在测序读取信号的过程中，信号强度差异小，得到的有效数据率高，适合于高通量的基因组测序。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894262
【申请号】CN201510300197
【发明人】蔡亦梅, 高静, 徐潇, 吴超, 张睿, 王者馥, 王绪敏, 殷金龙, 任鲁风
【申请人】北京中科紫鑫科技有限责任公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月4日