一种从萹蓄中提取、纯化萹蓄苷的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种从篇蓄中提取、纯化篇蓄苷的方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 篇蓄苷，CAS号：572-30-5 ;分子式：C2(lH18On;分子量：434. 35 ;性状：黄色针状晶 体；熔点217°C;无水物熔点为222°C。篇蓄苷具有抗炎、抑菌、抗病毒作用，还具有抗氧化作 用；结构式为：
篇蓄为寥科一年生草本植物，生长于田野、路旁、荒地及河边等处，每年小暑时间采取 茎叶，晒干作药用。主产于河南、四川、浙江、山东、吉林、河北等地。具有一定的药理作用。 全草含篇蓄甙、槲皮甙、d-儿茶精、没食子酸、咖啡酸、草酸、硅酸、绿原酸、P-香豆酸、粘质、 葡萄糖、果糖及蔗糖。硅酸的分布：叶1. 6%，茎0. 6%，根0. 4%(如用作硅酸盐药物，可在其整 个生长期采集，如用作黄酮药物，则宜于刚开花时采集)。
[0003] 经现代研宄证明，篇蓄具有的药理作用为：①利尿作用②降压作用③对子宫及止 血作用④抗菌作用。
[0004] 超临界流体结晶技术：超临界流体是指尚于流体临界点，以单相形式存在的流体， 其物理化学性质与非临界状态液体和气体有很大的不同。由于密度是溶解能力、粘度大小 是流体的阻力、扩散系数是传质速率高低的主要参数，素以流体的特殊物理性质决定了超 临界流体结晶技术的一系列重要特点。超临界流体的扩散系数比液体要大得多，粘度类似 于气体，远小于液体，有比液体快得多的溶解溶质和携带能力，这对传质极为有利，缩短了 相平衡所需的时间，是高效传质的理想介质。它具有不同寻常的巨大压缩性，通过简单的减 压、升温即会引起流体密度的很大变化，从而使其中的溶质迅速地过饱和结晶析出，所以超 临界流体是一种优良的结晶溶剂。而当在超临界流体中添加第二种、第三种有机溶剂后，还 能在很大程度上使改性超临界流体结晶的选择性大大提高。而且，能够方便地通过条件的 控制获取从亚微米级超细晶粒到常规大颗粒结晶，还可控制其粒度尺寸的分布。由于超临 界流体是一种介于气相与液相之间的状态，物质结晶时避免了相的冲突，克服了表面张力 的影响，固体微粒表面能不升高，因而生成的固体微粒不易发生聚集。超临界流体结晶技术 具备操作简便、速度快、产率高、溶剂易彻底除去而无二次污染、少污染或不污染环境等优 点。
[0005] 目前，国内很少见篇蓄苷提取方法的相关专利报道。在现有公开专利"一种制备 篇蓄苷的方法"（专利号201010549755. 9)中采用的工艺步骤为：包括将篇蓄药材粉碎，用 6-10倍量30-40%低碳醇回流提取2-3次，每次1-2h，合并提取液减压回收醇，趁热加入大 孔树脂柱中吸附，水洗无糖色，再用5-6BV30-60%低碳醇洗脱，洗脱液减压浓缩，浓缩液加 入水饱和正丁醇萃取2-3次，收集正丁醇层减压浓缩，加水回流趁热过滤，滤液调pH3-5放 置结晶，再依次用低碳醇、丙酮回流溶解重结晶，干燥即得产品。该法溶剂使用量大，操作过 程复杂，所得篇蓄苷纯度低。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种从篇蓄中提取、纯化篇蓄 苷的方法，此法操作简单，所得产品纯度高。
[0007] 为实现上述目的，一种从篇蓄中提取、纯化篇蓄苷的方法通过以下技术方案来实 现： 1) 材料预处理：取篇蓄经60~80°c干燥，粉碎，过40~80目筛； 2) 酶解：称取一定量的粗粉，加入料液比为1 :3~6的蒸馏水浸泡，并加入粗粉重量 0. 1%~0. 3%的生物酶在pH值4~5,温度为45~50°C的条件下酶解l~3h ; 3) 微波提取：酶解结束，将所得酶解物在温度为70~80°C的条件下微波提取，滤渣重复 提取2~3次，每次300~600s，过滤，收集滤液； 4) 纯化：滤液减压浓缩至无醇味，收集浓缩液通过超滤膜，收集透过液，将透过液上聚 酰胺树脂柱，先用5%~10%、2~4倍柱体积的乙醇洗脱，再用50~70%、3~5倍柱体积的乙醇洗 脱，收集洗脱液； 5) 超临界流体结晶：将洗脱液通过溶液泵以高压状态急速喷入结晶釜内，流速为 50~200ml/min，在结晶釜底部收集析出的篇蓄苷晶体。
[0008] 步骤2)中所述的生物酶为果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶中的一种或两种以上的 混合物。
[0009] 步骤3)中所述微波的提取功率为800~1000W。
[0010] 步骤4)中所述超滤膜可选用截留分子量为1000~5000的超滤膜。
[0011] 步骤5 )中所述结晶釜工作压力为10~20MPa，温度为30~40 °C，结晶时间为 30~IOOmin0
[0012] 本发明具有的优点为：1、采用了生物酶酶解辅助微波提取的提取方法，提取效率 高，溶剂用量少，对环境污染小；2、采用了超滤膜和聚酰胺树脂柱相结合的纯化方法，使得 所得产品纯度高；3、采用了超临界流体结晶技术，这种技术能够制备出平均粒径很小的细 微颗粒，同时还能控制粒度尺寸的分布，从而能增加药物的溶解度、改善吸收效率、提高生 物利用度，从而显著增强药效。
【具体实施方式】
[0013] 下面将结合【具体实施方式】进一步说明本发明。
[0014] 实施例1 : 取篇蓄经60°C干燥，粉碎，过40目筛；称取一定量的粗粉，加入料液比为1 :3的蒸馏 水浸泡，并加入粗粉重量〇. 1%的果胶酶在PH值为4,温度为45°C的条件下酶解Ih ;酶解结 束，将所得酶解物在70°C、800W的功率下微波提取，滤渣重复提取2次，每次300s，过滤，收 集滤液；滤液减压浓缩至无醇味，收集浓缩液通过截留分子量为1000的超滤膜，收集透过 液，将透过液上聚酰胺树脂柱，先用5%、2倍柱体积的乙醇洗脱，再用50%、3倍柱体积的乙醇 洗脱，收集洗脱液；将洗脱液通过溶液泵以高压状态急速喷入结晶釜内，流速为50ml/min， 在结晶釜底部收集析出的篇蓄苷晶体。结晶釜工作压力为lOMPa，温度为30°C，结晶时间为 30min。经HPLC检测，含量为92. 2%。
[0015] 实施例2 : 取篇蓄经70°C干燥，粉碎，过60目筛；称取一定量的粗粉，加入料液比为1 :5的蒸馏水 浸泡，并加入粗粉重量〇. 2%的纤维素酶和果胶酶混合物在pH值为4,温度为45°C的条件下 酶解2h ;酶解结束，将所得酶解物在75°C、1000W的功率下微波提取，滤渣重复提取2次，每 次500s，过滤，收集滤液；滤液减压浓缩至无醇味，收集浓缩液通过截留分子量为3000的超 滤膜，收集透过液，将透过液上聚酰胺树脂柱，先用7%、3倍柱体积的乙醇洗脱，再用60%、4 倍柱体积的乙醇洗脱，收集洗脱液；将洗脱液通过溶液泵以高压状态急速喷入结晶釜内，流 速为100ml/min，在结晶釜底部收集析出的篇蓄苷晶体。结晶釜工作压力为15MPa，温度为 35°C，结晶时间为70min。经HPLC检测，含量为93. 1%。
[0016] 实施例3: 取篇蓄经80°C干燥，粉碎，过80目筛；称取一定量的粗粉，加入料液比为1 :6的蒸馏水 浸泡，并加入粗粉重量〇. 3%的半纤维素酶在pH值为5,温度为50°C的条件下酶解3h ;酶解 结束，将所得酶解物在80°C、1000W的功率下微波提取，滤渣重复提取3次，每次600s，过滤， 收集滤液；滤液减压浓缩至无醇味，收集浓缩液通过截留分子量为5000超滤膜，收集透过 液，将透过液上聚酰胺树脂柱，先用1〇%、4倍柱体积的乙醇洗脱，再用70%、5倍柱体积的乙 醇洗脱，收集洗脱液；将洗脱液通过溶液泵以高压状态急速喷入结晶釜内，流速为200ml/ min，在结晶釜底部收集析出的篇蓄苷晶体。结晶釜工作压力为20MPa，温度为40°C，结晶时 间为IOOmin。经HPLC检测，含量为94. 2%。
【主权项】
1. 一种从篇蓄中提取、纯化篇蓄苷的方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 材料预处理：取篇蓄经60~80°C干燥，粉碎，过40~80目筛； 2) 酶解：称取一定量的粗粉，加入料液比为1 :3~6的蒸馏水浸泡，并加入粗粉重量 0. 1%~0. 3%的生物酶在pH值4~5,温度为45~50°C的条件下酶解l~3h; 3) 微波提取：酶解结束，将所得酶解物在温度为70~80°C的条件下微波提取，滤渣重复 提取2~3次，每次300~600s，过滤，收集滤液； 4) 纯化：滤液减压浓缩至无醇味，收集浓缩液通过超滤膜，收集透过液，将透过液上聚 酰胺树脂柱，先用5%~10%、2~4倍柱体积的乙醇洗脱，再用50~70%、3~5倍柱体积的乙醇洗 脱，收集洗脱液； 5) 超临界流体结晶：将洗脱液通过溶液泵以高压状态急速喷入结晶釜内，流速为 50~200ml/min，在结晶釜底部收集析出的篇蓄苷晶体。2. 根据权利要求1所述的一种从篇蓄中提取、纯化篇蓄苷的方法，其特征在于步骤2) 中所述的生物酶为果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶中的一种或两种以上的混合物。3. 根据权利要求1所述的一种从篇蓄中提取、纯化篇蓄苷的方法，其特征在于步骤3) 中所述微波的提取功率为800~ 1000W。4. 根据权利要求1所述的一种从篇蓄中提取、纯化篇蓄苷的方法，其特征在于步骤4) 中所述超滤膜可选用截留分子量为1〇〇〇~5000的超滤膜。5. 根据权利要求1所述的一种从篇蓄中提取、纯化篇蓄苷的方法，其特征在于步骤5) 中所述结晶釜工作压力为l〇~20MPa，温度为30~40°C，结晶时间为30~100min。
【专利摘要】本发明公开了一种从萹蓄中提取、纯化萹蓄苷的方法。其制备过程如下：取萹蓄经60~80℃干燥，粉碎，过40~80目筛；称取一定量的粗粉，加入料液比为1：3~6的蒸馏水浸泡，并加入粗粉重量0.1%~0.3%的生物酶酶解；酶解结束，将所得酶解物微波提取，滤渣重复提取2~3次，每次300~600s，过滤，收集滤液；滤液减压浓缩至无醇味，收集浓缩液通过超滤膜，收集透过液，将透过液上聚酰胺树脂柱，先用5%~10%、2~4倍柱体积的乙醇洗脱，再用50~70%、3~5倍柱体积的乙醇洗脱，收集洗脱液；将所得洗脱液采用超临界流体结晶技术制得萹蓄苷晶体。本方法高效、快速、应用范围广，适合高纯度萹蓄苷的生产。
【IPC分类】C07H17/07, C07H1/08
【公开号】CN104926895
【申请号】CN201510265035
【发明人】刘东锋, 杨成东
【申请人】南京泽朗医药科技有限公司
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年5月22日