一种体外快速扩增人自体造血干细胞的方法
【专利说明】
[0001]技术领域:
本发明涉及生物医学领域，具体来说，涉及细胞体外培养领域，尤其是一种体外快速扩增人自体造血干细胞的方法。
[0002]【背景技术】:
造血干细胞(Hematopoietic stem cells, HSCs)是血液系统中的成体干细胞，是一个异质性的群体，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。它是研宄历史最长且最为深入的一类成体干细胞，对研宄各类干细胞，如肿瘤干细胞，具有重要指导意义。
[0003]几十年来，造血干细胞在临床上应用于血液系统疾病的治疗，被证明是治疗恶性血液疾病的有效方法。造血干细胞还被证明具有横向分化能力，具有分化形成骨细胞、神经细胞和心肌细胞等多种细胞的潜能。所以，自体造血干细胞还被广泛应用于再生医学和修复医学领域的多种疾病的再生性修复治疗。
[0004]然而，造血干细胞应用于临床存一个问题，单次收集过程获得的骨髓细胞数量经常不足以用于移植，因此经常多次进行骨髓收集，该方法对病患者造成很大的损伤，并且容易产生交叉污染，细胞数量远远未达到临床标准需要。
[0005]因此，一种快速，有效，安全的扩增造血干细胞的方法亟需被建立。
[0006]
【发明内容】
:
本发明解决了一个在体外扩增成体造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)用于临床细胞数量达不到要求的主要问题。提供了一种体外快速制备自体造血干细胞的方法。
[0007]一种体外快速扩增人自体造血干细胞的方法:
(I)、自体血液的抽取；(2)、自体单核细胞的收集及分离；(3)、自体单核细胞的体外培养。
[0008]进一步的，无菌抽取自体血液100_200ml，密度梯度离心收集单核细胞，将自体单核细胞在细胞培养液中培养6天，收集生成的自体造血干细胞。
[0009]进一步的，所述步骤(2)自体单核细胞的收集及分离方法为:密度梯度离心法，具体步骤如下:
1).取自体抗凝全血100ml，加入等体积PBS，充分混匀；
2).分装到4个50ml提前各加入12.5ml淋巴细胞分离液(Ficoll)的离心管中；
3).700G，室温离心 20min，缓升缓降(without breaking)；
4).抽取白膜细胞层，加入到装有5ml RPMI1640的50ml离心管中；
5).加入45ml RPMI1640，260G，4°C离心 lOmin，废弃上清液;
6).加入 50ml RPMI1640,180G，4°C离心 lOmin，废弃上清液；
7).加入 50ml RPMI1640,110G，4°C离心 lOmin，废弃上清液；
8).加入30ml RPMI 1640，备用。
[0010]所述自体单核细胞的收集及分离方法中使用离心机为Eppendorf centrifuge5810:水平转子AT-4-62，离心半径16cm。
[0011]所述步骤(3)自体单核细胞的体外培养方法为:
基础培养液为RPMI1640，向基础培养液中添加添加物，所述添加物为人工合成的血细胞促成熟因子，培养基含有促红细胞生成素(erythropoietin, ΕΡ0)终浓度为2_20ng/ml，优选 10 ng/mlo
[0012]所述细胞培养液中的培养条件为:温度为37°C和5%的C02。
[0013]进一步的，自体单核细胞的体外具体培养方法为:
1.1OOml自体全血经淋巴细胞分离液分离，获得约I X 18个单个核细胞；
2.将细胞悬浮于30mlRPMI 1640，细胞浓度为约1.5-2.0X 106/ml，加入终浓度10 ng/ml ΕΡ0，将培养瓶置于37°C，5% C02培养箱条件下培养；
3.培养24 小时后，加入 IL-3 1000IU/ml, 10 ng/ml EPO ；
4.在3-4 天，加入 30ml 新鲜 RPMI 1640 (总体积 60ml)，并加入 IL-6 1000IU/ml，10ng/ml EPO；
5.在5-6 天，加入 60ml RPMI 1640 (总体积 120ml)，并加入 10 ng/ml EPO ；
6.第七天检测细菌真菌培养阴性；胎盘兰染色检验活细胞>95%，并收集细胞悬液离心去上清后，再用生理盐水洗涤2次即得高浓度的造血干细胞。
[0014]所述步骤3中IL-3 1000IU/ml，10 ng/ml EPO可加在步骤2中。
[0015]有益效果:
本发明通过对造血干细胞增殖过程中的关键调控因子的调控，向培养基中添加促红细胞生成素(erythropoietin, ΕΡ0)，提供了一种体外快速扩增自体造血干细胞的方法，所述方法简单，快速，有效，安全性高。本发明所述方法拟采用在实验室中对健康的HSCs进行扩增，供者只需从体内提供更少量的造血干细胞，同时它为成体造血干细胞冻存和存储提供可行性基础。
[0016]【附图说明】:
图1:人血液单个核细胞EPO蛋白快速体外增殖后所得人自体造血干细胞CD34特异表型鉴定图，(A)增殖前，(B)增殖后。
[0017]【具体实施方式】:
实施例1
(I)所有试剂及培养基(RPMI 1640 + 10 ng/ml EPO + 1000IU/ml IL-6)均在无菌条件下，在百万级洁净度的生物安全操作台操作，低温(4-10°C)条件下配制，经0.22微米孔径的滤膜过滤制成。
[0018](2)采集健康人血液100ml，使用密度梯度离心方法分离获取血液单个核细胞。将获得的单个核细胞以5X 16个/ml的密度，接种于细胞培养瓶中，并向其中加入步骤(I)中配制的细胞培养液，在37 °〇和5%的CO2的培养箱中培养7天从而获得EPO蛋白快速诱导的自体造血干细胞。
[0019](3)所得自体造血干细胞转化率的测定
1.流式细胞仪测定所得自体造血干细胞的CD34+细胞得率
2.将所得人自体造血干细胞移到EP管中，在1024转/分钟下常温下离心5min。
[0020]3.去除上清液，每管加入400 μ I的封闭液(2%FCS，1%SA用PBS稀释)重悬浮细胞沉淀。
[0021]4.向EP管中加入20 μ I的荧光标志的⑶34单克隆抗体试剂。混匀之后放在黑暗处孵育30min，后进行流式细胞仪分析，自动计算标本中的CD34阳性细胞数量及百分比。结果见图1。
【主权项】
1.一种体外快速扩增人自体造血干细胞的方法，包括: (I)、自体血液的抽取；(2)、自体单核细胞的收集及分离；(3)、自体单核细胞的体外培养，所述自体单核细胞的收集及分离采用密度梯度离心法，所述自体单核细胞的体外培养使用的培养基为RPMI1640。2.如权利要求1所述的一种体外快速扩增人自体造血干细胞的方法，其特征在于:所述培养基中还添加人工合成的血细胞促成熟因子。3.如权利要求2所述的一种体外快速扩增人自体造血干细胞的方法，其特征在于:所述人工合成的血细胞促成熟因子，含有促红细胞生成素终浓度2-20ng/ml。4.如权利要求3所述的一种体外快速扩增人自体造血干细胞的方法，其特征在于:所述促红细胞生成素终浓度为10 ng/mlo
【专利摘要】本发明提供了一种体外快速制备人自体造血干细胞的方法，所述方法包括：1、自体血液的抽取；2、自体单核细胞的收集及分离；3、自体单核细胞的体外培养。所述自体单核细胞体外培养使用细胞培养基是RPMI1640，在培养基中添加人工合成的血细胞促成熟因子。本发明所述的人自体造血干细胞扩增方法在产量、纯度、生产速度及安全性方面具有显著优势。
【IPC分类】C12N5/0789
【公开号】CN104928245
【申请号】CN201510311177
【发明人】冯文峰, 黄鹏, 昌芒
【申请人】广州思丹福生物科技有限公司
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年6月9日