胆固醇在促进鸡原始生殖细胞增殖中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于胆固醇用途领域，尤其涉及胆固醇在促进鸡原始生殖细胞增殖中的应 用。
【背景技术】
[0002] 鸡原始生殖细胞（PGCs)作为产生精子和卵子的前体细胞，可以把基因从上一代 传递到下一代，在生产转基因鸡和保存濒危物种的遗传资源中具有广阔的应用前景。转基 因鸡一方面可以应用于育种工作，生产选育出抗病、高产的优质品种；另一方面可以作为生 物反应器生产医用蛋白质等生物活性物质。利用冷冻保存的鸡PGCs进行优质品种尤其是 濒临灭绝的品种质资源的保种工作有着巨大的意义。而建立一个能使鸡原始生殖细胞有效 增殖和传代的体外培养系统则是这些应用的前提条件。
[0003] 有研宄表明，胆固醇可刺激Sonic Hedgehog信号通路信号传递，从而促进肿瘤细 胞的增殖。以往研宄中，探宄过多种胆固醇在不同浓度下对其增殖的影响，发现胆固醇能促 进肿瘤细胞增殖。已有研宄表明，Sonic Hedgehog信号通路信号在鸡中是保守的，但对鸡 生殖细胞中Sonic Hedgehog信号通路信号的研宄尚未见报道。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供胆固醇在促进鸡原始生殖细胞增殖中的应用。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0006] 胆固醇在促进鸡原始生殖细胞增殖中的非诊断和非治疗目的的应用。
[0007] 胆固醇在促进鸡原始生殖细胞增殖中的非诊断和非治疗目的的应用，体外培养鸡 原始生殖细胞应用的胆固醇浓度为0. 5-2 μ M。
[0008] 胆固醇在促进鸡原始生殖细胞增殖中的非诊断和非治疗目的的应用，体外培养鸡 原始生殖细胞应用的胆固醇浓度为2 μ Μ。
[0009] 胆固醇在制备促进鸡原始生殖细胞增殖的药物中的应用。
[0010] 虽然在自我更新与增殖的方面肿瘤细胞与干细胞存在相似之处，但肿瘤细胞与鸡 原始生殖细胞仍然存在显著不同，鸡原始生殖细胞作为精子和卵子的前体细胞，具有发育 的潜能，此外，所用鸡原始生殖细胞是从鸡胚中分离出来的，而鸡胚所附着的卵黄中胆固醇 的含量是远远高于肿瘤细胞的。为此，发明人深入研宄了胆固醇对鸡原始生殖细胞增殖的 影响。结果表明，在现有的培养鸡原始生殖细胞培养液基础上添加胆固醇，可促进鸡原始生 殖细胞的增殖。根据加入胆固醇浓度的不同，其对鸡原始生殖细胞增殖的促进程度不同， 当胆固醇浓度为2 μΜ时其作用效果最显著，能有效地促进鸡原始生殖细胞在体外的增殖， 且在含该浓度胆固醇的培养液中鸡原始生殖细胞能很好的维持其生物学特性。
【附图说明】
[0011] 图1是不同浓度胆固醇对PGC增殖的影响图。
[0012] 图2是PGC特定基因 RT-PCR鉴定电泳图，图中：lcKO培养液培养PGC，2 25-羟基 胆甾醇共培养PGC，3DF-1。
【具体实施方式】
[0013] 实施例1
[0014] 1.配制培养液
[0015] (l)cKO 培养液
[0016] KO-DMEM 75.8 %, KO-BRl-CM 10 %, Hyclone Defined FBS 7.5 %, Chicken serum 2. 5 %, GS nucleoside supplement lx, pen/strep lx，GlutaMAX lx, b-MercaptoethanolO. ImM, hFGFb 4ng/ml
[0017] (2)胆固醇培养液
[0018] KO-DMEM 75.8 %, K0-BR1-CM 10 %, Hyclone Defined FBS 7.5 %, Chicken serum 2. 5 %, GS nucleoside supplement lx, pen/strep lx，GlutaMAX lx, b-MercaptoethanolO. ImM，hFGFb 4ng/ml，Cholesterol (胆固醇）0· 5 μ M、I μ M、2 μ M0
[0019] 2.接种细胞
[0020] (1)解冻PGC细胞接种到铺有饲养层的35mm培养皿中，待其长满进行传代。
[0021] (2)细胞计数。
[0022] 3.添加胆固醇
[0023] 细胞计数后，将培养液分成4管，每管6 X IO4个PGC，离心，吸走上清，再分别用cKO 培养液（对照组），含〇. 5 μ M，1 μ M，2 μ M胆固醇的CKO培养液2ml重悬，每管接种到一个4 孔板的3个孔（每孔500 μ 1)，共4个板。
[0024] 4.细胞计数
[0025] (1)添加胆固醇处理后，60h时每孔添加500 μ 1对应培养液。
[0026] (2)120h后细胞计数，收集细胞于离心管中，取100μ1到EP管中，再加入100μ1 台盼蓝，混匀，取20 μ 1注入计数板计数，结果见表1和图1。通过单因素方差分析，1 μΜ胆 固醇和对照组相比差异不显著，2 μ M胆固醇与对照组相比差异极显著，说明2 μ M胆固醇对 PGC的增殖有促进作用，从而确定了 2 μΜ胆固醇作为本培养体系的最佳处理浓度。
[0027] 表1不同浓度胆固醇对PGC增殖的影响
[0028]
[0029] 实施例2
[0030] 用cKO培养液以及含有2 μΜ胆固醇的cKO培养液，分别培养PGC三天后，采用 OMEGA的RNA提取试剂盒（CAT#R6834-01)以及天根反转录试剂盒（CAT#KR106-02)，分别得 到3种培养液培养3天后PGC的cDNA，随后利用NCBI数据库（http://www. ncbi. nlm. nih. gov)查找CVH、CDH、DAZL、Nanog、PouV序列，设计引物（引物序列见表2)，以得到的cDNA 为模板，以相应的引物进行RT-PCR，PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，见图2,结果显示 CVHXDH、DAZL、Nanog、PouV，这5个基因在含2 μ M胆固醇的培养液培养后仍然能高度表达， 说明这种培养液均能很好地维持鸡原始生殖细胞的生物学特性。
[0031] 表2 RT-PCR引物序列
【主权项】
1. 胆固醇在促进鸡原始生殖细胞增殖中的非诊断和非治疗目的的应用。2. 胆固醇在促进鸡原始生殖细胞增殖中的非诊断和非治疗目的的应用，其特征在于体 外培养鸡原始生殖细胞应用的胆固醇浓度为〇. 5-2 yM。3. 胆固醇在促进鸡原始生殖细胞增殖中的非诊断和非治疗目的的应用，其特征在于体 外培养鸡原始生殖细胞应用的胆固醇浓度为2 y M。4. 胆固醇在制备促进鸡原始生殖细胞增殖的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了胆固醇在促进鸡原始生殖细胞增殖中的应用。发明人深入研究了胆固醇对鸡原始生殖细胞增殖的影响。结果表明，在现有的培养鸡原始生殖细胞培养液基础上添加胆固醇，可促进鸡原始生殖细胞的增殖。根据加入胆固醇浓度的不同，其对鸡原始生殖细胞增殖的促进程度不同，当胆固醇浓度为2μM时其作用效果最显著，能有效地促进鸡原始生殖细胞在体外的增殖，且在含该浓度胆固醇的培养液中鸡原始生殖细胞能很好的维持其生物学特性。
【IPC分类】A61P15/08, A61K31/575, C12N5/076, C12N5/075
【公开号】CN104946582
【申请号】CN201510311772
【发明人】陆阳清, 陈东阳, 张文馨, 陈美娟, 魏巍
【申请人】广西大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年6月9日