一种制备螺旋霉素碱产生菌生二素灰色链霉菌孢子的方法
【技术领域】 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种制备螺旋霉素碱产生菌生二素灰色链霉菌孢 子的方法。
【背景技术】
[0002] 孢子制备是发酵工业生产中不可缺少的一个环节，孢子质量的好坏将直接影响到发酵 生产的成功与否。国内螺旋霉素碱发酵生产所用的生二素灰色链霉菌是经过诱变得到的， 一般得不到孢子，靠斜面传代，菌丝保藏。螺旋霉素SPM的合成基因部分为质粒基因，质粒 基因容易丢失。因此，螺旋霉素SPM生产菌种不太稳定，性能容易衰退。菌种生产能力的保 持是菌种选育和抗生素生产中最重要的问题。众所周知，在不断地重复培养过程中会导致 菌种生产能力下降，而菌丝冷冻保藏，保藏期较短，不得不在生产中频繁更换菌种批号，增 加传代次数，造成生产的不稳定，同时也加大了菌种制备的工作量。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种制备螺旋霉素碱产生菌生二素灰色链霉菌孢子的方法，以 有效提高生产批次的产量、减少菌种传代次数、防止菌种退化、提高菌种保藏期限。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 一种制备螺旋霉素碱产生菌生二素灰色链霉菌孢子的方法，包括以下步骤： a. 平板培养基的制备：采用玉米淀粉4%、淀粉酶0. 03%、黄豆饼粉1%、氯化钠0. 4%、七 水硫酸镁〇. 05%、碳酸钙0. 5%、琼脂1%、余量为蒸馏水的质量百分比例配制平板培养基，将 平板培养基经过灭菌倒入培养皿中； b. 菌悬液的制备：取预先选定的优质冷冻管作为出发菌株，接种到种子摇瓶中，在摇床 上培养40~48小时，在无菌条件下，吸取种子液放到装有玻璃珠的三角瓶中，手振荡5~10分 钟，然后过滤于另一三角瓶即成菌悬液； c. 单菌落孢子的培养：将菌悬液按10倍的浓度梯度稀释至10 2、10 3、10 4,将三个浓度 的菌悬液分别加入到步骤a得到的不同培养皿的平板培养基上，在温度为27±0. 5°C、湿度 为40%~50%条件下培养18~20天； d. 斜面培养基的制备：采用玉米淀粉4%、淀粉酶0. 03%、黄豆饼粉1%、氯化钠0. 4%、七 水硫酸镁〇. 05%、碳酸钙0. 5%、琼脂1%、余量为蒸馏水的比例配制斜面培养基，将斜面培养 基分装到试管中，经灭菌后摆斜面； e. 单菌落孢子斜面的制备：选择步骤c制得的规则、丰满的单菌落孢子，用灭过菌的接 种铲轻轻刮下孢子，均匀涂在步骤d得到的空白斜面上，每个单菌落只传一支斜面，传好后 塞紧棉塞用无菌滤纸包扎，在温度为27±0. 5°C、湿度为40%~50%条件下培养18~20天； f. 摇瓶初筛和摇瓶复筛：取培养成熟的步骤e中的孢子斜面试管，进行单菌落孢子的 摇瓶初筛和摇瓶复筛，选出生产能力强的单菌落孢子斜面； g. 孢子斜面保藏。
[0005]平板培养基和斜面培养基配制过程中用85°C水浴15分钟，灭菌时在0.IMPa、 121°C的条件下灭菌30分钟，灭菌结束后保压降温。
[0006] 本发明的优点在于发明了全新的培养基配方，使螺旋霉素碱产生菌在这种培养基 上能够产生孢子，为实现孢子保藏菌种提供了基本来源。与原有的旧培养基相比，有以下优 占. 2.新旧配方比较： a. 本发明新的制备方法可以产生孢子，而旧培养基只能产生菌丝； b. 本发明获得的成熟孢子斜面置1~7°C冰箱中保存可达一个月之久待用；而现有成 熟的菌丝斜面置1~7°C冰箱中保存两周即退化，为防止待用菌丝斜面退化，必须尽快传代 维持菌丝活力； c. 本发明获得的孢子斜面可制作牛奶管进行菌种保藏，一般至少可保存6年；而现有 的菌丝斜面不宜制作牛奶管，一般采用冷冻管保藏，保存时间为2~3年； d. 在时间上，无论是斜面待用保存还是菌种保藏，本发明得到的孢子斜面均比现有的 菌丝斜面有优势，利用孢子保藏菌种，可减少菌种在复壮选育过程中和制备过程中的传代 次数，防止菌种退化，延长了菌种保藏时间，达到了提高工作效率和增产降耗的目的。
【具体实施方式】
[0007] 实施例1 一种制备螺旋霉素碱产生菌生二素灰色链霉菌孢子的方法，包括以下步骤： a. 平板培养基的制备： (1) 按照玉米淀粉4%、淀粉酶0. 03%、黄豆冰粉1%、氯化钠0. 4%、七水硫酸镁0. 05%、碳 酸钙0. 5%、琼脂1%、余量为蒸馏水的比例配制平板培养基； (2) 将上面的平板培养基用85°C水浴15分钟，然后一边摇匀一边分装于规格为500ml 三角瓶内，每瓶装200ml;在0.lMPa、121°C的条件下灭菌30分钟，灭菌结束后保压降温； (3) 将灭菌后的平板分离培养基趁热摇匀，待冷却至60°C左右一边摇匀一边分别倒入 直径为90mm的灭菌培养皿中，每只培养皿大约25ml平板培养基；倒好的培养皿放平加盖， 待平板培养基冷却凝固后置37°C恒温箱培养48h，经无菌检查合格后备用； b. 菌悬液的制备： 取一支预先选定的优质冷冻管（内装有生二素灰色链霉菌菌丝体）作为出发菌株，接种 到种子摇瓶中，在摇床上培养44小时，在无菌条件下，吸取10ml种子液放到装有玻璃珠的 三角瓶中，手振荡8分钟，然后过滤于另一三角瓶即成菌悬液； c. 单菌落孢子的培养： (1)用灭菌移液管吸取步骤b的菌悬液，按10倍的浓度梯度稀释至10 2、10 3、10 4,分 别吸取以上三个浓度的菌悬液加到步骤a不同培养皿的平板培养基上，每个平板培养基加 入0. 1~0. 3ml，然后灭菌接种耙涂布均匀，接种好的培养皿加盖，正面向上集中用无菌滤纸 包扎； (2)将无菌滤纸包扎好的培养皿正面向上水平放置在恒温培养室或生化培养箱内，在 温度为27±0. 5°C、相对湿度为40%~50%条件下培养，1天后将培养皿翻转培养，培养周期 18~20 天； d. 斜面培养基的制备： (1) 按照玉米淀粉4%、淀粉酶0. 03%、黄豆冰粉1%、氯化钠0. 4%、七水硫酸镁0. 05%、碳 酸钙0. 5%、琼脂1%、余量为蒸馏水的比例配制斜面培养基； (2) 将上面的斜面培养基85°(：水浴15分钟，然后一边摇匀一边分装于规格为30*200臟 试管中，每管装量20ml，塞紧棉塞，用一层牛皮纸包扎； (3) 在0.lMPa、121°C的条件下灭菌30分钟，灭菌结束后保压降温； (4) 将灭菌后的斜面培养基趁热摇匀，待冷却至60°C左右摆成斜面，冷却凝固后置 37°C恒温箱培养48h，经无菌检查合格后备用； e. 单菌落孢子斜面的制备： 取步骤c培养好平板单菌落，选择丰满、规则的单菌落，用灭过菌的接种铲轻轻刮下孢 子，均匀涂在步骤d的空白斜面上，每个单菌落只传1支斜面，传好后塞紧棉塞用无菌滤纸 包扎，在温度为27±0. 5°C、湿度为40%~50%条件下培养18~20天。
[0008] f.摇瓶初筛和摇瓶复筛： 取步骤e培养成熟的孢子斜面试管，在无菌条件下，用灭过菌的接种铲将每支成熟斜 面分别挖块约lcm2大小至摇瓶内进行单菌落孢子的摇瓶初筛和摇瓶复筛，选出生产能力强 的单菌落孢子斜面。
[0009] g?孢子斜面保藏。
[0010] 上述制得的孢子斜面制作牛奶管进行菌种保藏，将保藏不同时间的牛奶管考察， 结果见下表：
对照实施例： 现有的菌丝斜面制备方法： 与实施例1的不同之处在于：平板培养基和斜面培养基的质量百分比配方为：玉米淀 粉4%、蛋白胨0. 5%、黄豆饼粉2%、氯化钠0. 2%、玉米浆0. 5%、碳酸钙0. 5%、琼脂1. 8~2. 0%、 余量为水。步骤f?选出生产能力强的单菌落菌丝斜面后，用甘油作保护剂将培养成熟的种 子液制作冷冻管于-18~_25°C的冰柜中冷冻保藏。
[0011] 对照实施例选取三支成熟的菌丝斜面（1#斜面、2#斜面、3#斜面）时间进行考察， 每支三个平行，结果如下表：
由以上两表可看出，菌丝斜面随保存时间的延长退化非常迅速，若要维持菌丝活力，就 要及时传代或进行制种保藏，而冷冻管保藏时间仅有2~3年时间。本发明得到的是孢子斜 面，制作成牛奶管后退化不明显，至少可保存6年，孢子斜面可以减少传代次数，延长菌种 保藏时间，达到了提高工作效率和增产降耗的目的。
【主权项】
1. 一种制备螺旋霉素碱产生菌生二素灰色链霉菌孢子的方法，其特征在于，包括以下 步骤： a. 平板培养基的制备：采用玉米淀粉4±0. 54%、淀粉酶0. 03 ±0. 005%、黄豆饼 粉1 ± 0. 05%、氯化钠0. 4 ± 0. 05%、七水硫酸镁0. 05 ± 0. 005%、碳酸钙0. 5 ± 0. 05%、琼脂 1±〇. 5%、余量为蒸馏水的比例配制平板培养基，将平板培养基经过灭菌倒入培养皿中； b. 菌悬液的制备：取预先选定的装有菌丝体的优质冷冻管作为出发菌株，接种到种 子摇瓶中，在摇床上培养40~48小时，在无菌条件下，吸取种子液放到装有玻璃珠的三角瓶 中，手振荡5~10分钟，然后过滤于另一三角瓶即成菌悬液； c. 单菌落孢子的培养：将菌悬液按10倍的浓度梯度稀释至10 2、10 3、10 4,将三个浓度 的菌悬液分别加入到步骤a得到的不同培养皿的平板培养基上，在温度为27±0. 5°C、湿度 为40%~50%条件下培养18~20天； d. 斜面培养基的制备：采用玉米淀粉4%、淀粉酶0. 03%、黄豆饼粉1%、氯化钠0. 4%、七 水硫酸镁〇. 05%、碳酸钙0. 5%、琼脂1%、余量为蒸馏水的比例配制斜面培养基，将斜面培养 基分装到试管中，经灭菌后摆斜面； e. 单菌落孢子斜面的制备：选择步骤c制得的规则、丰满的单菌落孢子，用灭过菌的接 种铲轻轻刮下孢子，均匀涂在步骤d得到的空白斜面上，每个单菌落只传一支斜面，传好后 塞紧棉塞用无菌滤纸包扎，在温度为27±0. 5°C、湿度为40%~50%条件下培养18~20天； f. 摇瓶初筛和摇瓶复筛：取培养成熟的步骤e中的孢子斜面试管，进行单菌落孢子的 摇瓶初筛和摇瓶复筛，选出生产能力强的单菌落孢子斜面； g. 孢子斜面保藏。2. 如权利要求1所述的制备螺旋霉素碱产生菌生二素灰色链霉菌孢子的方法，其特征 在于：平板培养基和斜面培养基配制过程中用85°C水浴15分钟，灭菌时在0. lMPa、121°C的 条件下灭菌30分钟，灭菌结束后保压降温。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体涉及一种制备螺旋霉素碱产生菌生二素灰色链霉菌孢子的方法。该方法中平板培养基的制备为：采用玉米淀粉4%、淀粉酶0.03%、黄豆饼粉1%、氯化钠0.4%、七水硫酸镁0.05%、碳酸钙0.5%、琼脂1%、余量为蒸馏水的比例配制平板培养基，将平板培养基经过灭菌倒入培养皿中。本发明新的制备方法可以产生孢子，获得的孢子斜面可制作牛奶管进行菌种保藏，一般至少可保存6年。
【IPC分类】C12N3/00, C12R1/545
【公开号】CN105062948
【申请号】CN201510459519
【发明人】刘守强, 冯汇, 朱晓莉, 赵抗洪, 刘俭国, 翟明礼, 孟新梅, 刘丽杰, 王雪洁, 薛娟, 陈双, 王蕊, 周晨曦, 李慧
【申请人】天方药业有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月31日