一种通过纳米金颗粒介导基因转染诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属细胞生物学和发育生物学领域，具体涉及一种通过纳米金颗粒介导基因 转染诱导人脐带间充质干细胞分化睾丸间质细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 男性更年期综合征，是由于睾丸的萎缩，睾丸酮的分泌减少，萎缩的睾丸对促性腺 激素的反应降低，使体内性激素的调节功能失衡而引起的一系列症状。主要表现为精神心 理症状：精力不集中，记忆力减退，抑郁，焦虑，易怒，多疑，神经质，工作能力下降。血管舒缩 症状有心悸，潮热，出汗。性方面的症状有性兴趣降低，性欲降低，阳痿。生理体能症状有睡 眠减少，容易疲劳，食欲不振，骨骼与关节疼痛。
[0003]目前临床主要应用化学合成的雄性激素进行替代治疗。然而人体长期应用化学合 成雄激素易引起肝功能损害、高血脂症及前列腺癌等并发症，短期过量补充还可引起人情 绪不稳等多种副反应。近年来国内外专家尝试开展了近亲供体移植术或干细胞移植术治疗 睾丸损失或男性性腺低下症，取得较好效果。但这种移植术存在供体来源有限、手术复杂、 经费高等缺点，受者需长期服用免疫抑制剂等。
[0004] 近来，调节睾丸间质细胞合成分泌雄激素的因素也越来越受到人们的重视。经调 研，尚未见经纳米金颗粒介导基因转染诱导人脐带间充质干细胞分化睾丸间质细胞的方法 相关报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是构建一种通过纳米金颗粒介导基因转染诱导人脐带间充质 干细胞分化睾丸间质细胞的方法，主要是通过10-30nm直径的纳米胶体金颗粒将类固醇生 成因子 1(SteroidogenicFactor1，SF_1)和促黄体生成激素受体（luteotropichormone receptor，LHR)质粒共转染入人脐带间充质干细胞，然后用化合物或生长因子诱导人脐带 间充质干细胞定向分化为睾丸间质细胞，进而分泌生成睾酮。
[0006] -种通过纳米金颗粒介导基因转染诱导人脐带间充质干细胞分化睾丸间质细胞 的方法，包含以下步骤： 1) 纳米金颗粒的合成，纳米金颗粒对基因载体的包被，纳米金颗粒介导的基因转染； 2) 采用化合物或生长因子诱导人脐带间充质干细胞定向分化为睾丸间质细胞 所述纳米金颗料为直径10-30nm的纳米胶体金颗粒，优选20nm。
[0007] 所述纳米金颗料的合成过程如下： (1)将氯金酸（HAuC14)配制成0.01 %水溶液，取100mL加热至沸。
[0008] (2)搅动下准确加入1. 5mL的1%柠檬酸三钠（Na3C6H507 ? 2H20)水溶液。
[0009] (3)继续加热煮沸15min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入 后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。全过程约2 - 3min。
[0010] (4)冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积备用。
[0011] 所述纳米金颗粒介导的基因包被及基因转染，其步骤如下： 将人脐带间充质干细胞进行常规贴壁培养，按6孔培养板中每孔4X105个细胞，并按 以下试剂量操作：取两种待转质粒（分别含类固醇生成因子1基因和促黄体生成激素受体 基因）各2yg溶于100y1PBS缓冲液，再加入16y1纳米金颗粒溶液，涡旋Is混匀，室温 放置2-5min后加入细胞中；转染24小时更换培养液后换成诱导培养液； 采用化合物或生长因子诱导人脐带间充质干细胞定向分化为睾丸间质细胞，在转染24 小时后加入以下配方的诱导培养基：5X10 7mol/L维A酸和lX103mol/L8-溴-环磷腺 苷，诱导分化7天后，检测睾丸间质细胞中类固醇合成相关蛋白。
[0012] 有益效果： 本发明提供一种通过纳米金颗粒介导基因转染诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸 间质细胞的方法，所述方法高效、安全，分化后的睾丸间质细胞可作为研究替代模型；可用 于以睾丸间质细胞在临床上细胞治疗的种子细胞，提高睾丸间质细胞再生替代治疗的应用 前景。
[0013] 所述方法开拓了一种新的干细胞基因转染途径，为干细胞分化为睾丸间质细胞提 供一种高效、安全的方法； 所述方法分化后的睾丸间质细胞能作为研究睾丸间质细胞分泌调节功能影响因素研 究的替代模型。
【具体实施方式】
[0014] 下面通过具体的实施例对本发明的技术方案进行详细的说明，但是本发明的范围 不受这些实施例的限制。
[0015] -种通过纳米金颗粒介导基因转染诱导人脐带间充质干细胞分化睾丸间质细胞 的方法，包含以下步骤： 3) 纳米金颗粒的合成，纳米金颗粒对基因载体的包被，纳米金颗粒介导的基因转染； 4) 采用化合物或生长因子诱导人脐带间充质干细胞定向分化为睾丸间质细胞 所述纳米金颗料的合成过程如下： (1)将氯金酸（HAuC14)配制成0.01 %水溶液，取100mL加热至沸。
[0016] (2)搅动下准确加入1. 5mL的1%柠檬酸三钠（Na3C6H507 ? 2H20)水溶液。
[0017] (3)继续加热煮沸15min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入 后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。全过程约2 - 3min。
[0018] (4)冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积备用。
[0019] 所述纳米金颗粒介导的基因包被及基因转染，其步骤如下： 将人脐带间充质干细胞进行常规贴壁培养，按6孔培养板中每孔4X105个细胞，L-DMEM+ 5%FBS培养基，培养箱温度37度，C02浓度为5%，并按以下试剂量操作：取两种待转质粒 (分别含类固醇生成因子1基因和促黄体生成激素受体基因）各2yg溶于100y1PBS缓 冲液，再加入16y1纳米金颗粒溶液，涡旋Is混匀，室温放置2-5min后加入细胞中；转染24 小时更换培养液后换成诱导培养液； 采用化合物或生长因子诱导人脐带间充质干细胞定向分化为睾丸间质细胞，在转染24 小时后加入以下配方的诱导培养基：5X10 7mol/L维A酸和lX103mol/L8-溴-环磷腺 苷，诱导分化7天后，检测睾丸间质细胞中类固醇合成相关蛋白。
[0020] 使用放射性免疫法检测由间充质干细胞定向分化成的睾丸间质细胞分泌睾酮的 情况。
[0021] 具体检测方法为：睾酮分泌测定按照睾酮测定试剂盒说明书进行。取出酶标板， 依照次序对应分别加入50yL的标准品于空白微孔中；分别标记样品编号，加入50yL样 品于空白微孔中；在标准品孔和样品孔中加入100yL的酶标记洛液；37C解育反应60min; 浓缩洗液与蒸馏水1 :20倍稀释后清洗酶标板5次，每次静置10 - 20S;每孔加入底物A、B 液各50yL;37°C下避光孵育反应15min;每孔加入50yL终止液，终止反应。在波长450nm 的酶标仪上测定0D值，通过标准曲线得出睾酮浓度值。
[0022] 结果表明，测得溶剂对照组睾酮含量0. 20nmol/L，诱导组分化而来的细胞具有分 泌睾酮的能力，三次平行实验睾酮浓度分别为 0. 95nmol/L，0. 91nmol/L和0. 98nmol/L(见表1 )，对照组所得睾酮含量为分化试剂中 的血清背景影响。
[0023] 表1 :未分化及分化后细胞培养液中睾酮的含量
在上述实施例中，对本发明的最佳实施方式做了描述，很显然，在本发明的发明构思 下，仍可做出很多变化。在此，应该说明，在本发明的发明构思下所做出的任何改变都将落 入本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种通过纳米金颗粒介导基因转染诱导人脐带间充质干细胞分化睾丸间质细胞的 方法，其特征在于包括以下步骤： 纳米金颗粒的合成，纳米金颗粒对基因载体的包被，纳米金颗粒介导的基因转染； 采用化合物或生长因子诱导人脐带间充质干细胞定向分化为睾丸间质细胞。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述纳米金颗料为直径10_30nm的纳米胶 体金颗粒。3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述纳米金颗料为直径20nm的纳米胶 体金颗粒。4. 如权利要求1所述的方法，其他在于：所述纳米金颗粒的合成过程为： (1) 将氯金酸（HAuC14)配制成0.01 %水溶液，取100 mL加热至沸； (2) 搅动下准确加入I. 5mL的1%柠檬酸三钠（Na3C6H507 ? 2H20)水溶液； (3) 继续加热煮沸15min，此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很 快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色，全过程2 - 3 min ; (4) 冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积备用。5. 权利要求1所述的方法，其特征在于：所述纳米金颗粒对基因载体的包被，纳米金颗 粒介导的基因转染过程为： 将人脐带间充质干细胞进行常规贴壁培养，按6孔培养板中每孔4X IO5个细胞，并按 以下试剂量操作：取两种待转质粒（分别含类固醇生成因子1基因和促黄体生成激素受体 基因）各2 y g溶于100 y I PBS缓冲液，再加入16 y 1纳米金颗粒溶液，涡旋Is混匀，室温 放置2-5min后加入细胞中；转染24小时更换培养液后换成诱导培养液。6. 权利要求1或5所述的方法，其特征在于：所述采用化合物或生长因子诱导人脐带 间充质干细胞定向分化为睾丸间质细胞，诱导培养基为：在基础培养基中添加5X10 7mol/ L维A酸和I X 10 3mol/L8_溴-环磷腺苷。
【专利摘要】本发明提供一种导人脐带间充质干细胞分化睾丸间质细胞的方法，是将带有类固醇生成因子1基因和促黄体生成激素受体基因的质粒通过纳米金颗粒共转染入人脐带间充质干细胞，然后用化合物或生长因子诱导人脐带间充质干细胞定向分化为睾丸间质细胞。本发明提供一种高效、安全的睾丸间质细胞分化方法以，分化后的睾丸间质细胞可作为研究替代模型；可用于以睾丸间质细胞在临床上细胞治疗的种子细胞，提高睾丸间质细胞再生替代治疗的应用前景。
【IPC分类】C12N5/077, C12N5/10
【公开号】CN105062978
【申请号】CN201510498088
【发明人】冯文峰, 黄鹏, 昌芒
【申请人】广州思丹福生物科技有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月14日