内切型β琼胶酶AgaB的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及琼胶酶，尤其是涉及一种内切型e琼胶酶AgaB的制备方法。
【背景技术】
[0002] 琼胶酶是一类微生物获取外界碳源的工具酶，能够将大分子的琼脂糖降解成小分 子的琼胶寡糖。由于其降解琼脂糖的属性，因此经常被用于DNA回收，藻类原生质体制备等 领域。随着海藻寡糖研究的兴起与深入，越来越多的研究证明，琼胶寡糖具有多种生理功 能，例如抗癌、抗炎、抗氧化、美白、增加肠道益生菌等。与传统的酸碱制备法相比，琼胶酶酶 解法高效、温和、低耗、产物稳定，是制备琼胶寡糖的首选方法。因此，琼胶酶具有一定的科 研与医疗保健应用价值。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种内切型0琼胶酶AgaB的制备方法。
[0004] 本发明包括以下步骤：
[0005] 1)琼胶酶菌株Flammeovirgasp.SJP92 的发酵；
[0006] 2)琼胶酶菌株Flammeovirgasp.SJP92发酵液的硫酸铵盐析；
[0007] 3)AgaB粗酶液经DEAE琼脂糖离子层析纯化。
[0008] 所述Flammeovirgasp.SJP920 -琼胶酶已于2014年11月27日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学 院微生物研究所，邮编：1〇〇1〇1，保藏中心登记入册编号：CGMCCNo. 10071。
[0009] 本发明通过琼胶酶菌株Flammeovirgasp.SJP92的发酵，将发酵液经硫酸铵盐析 以及DEAE琼脂糖离子层析等步骤纯化得到内切型0琼胶酶AgaB。纯化得到的这两种琼胶 酶纯度高，活力好，为其实际应用提供了基础，同时，这两种琼胶酶纯化工艺的建立也为其 工业化应用奠定了基础。
【附图说明】
[0010] 图1为AgaB的SDS-PAGE与酶活染色图。M:蛋白质分子质量标准品；1 :AgaB的 SDS-PAGE;2:AgaB的酶活染色。
[0011] 图2为pH值对AgaB活力的影响。横坐标为pH值，纵坐标为相对活力。
[0012] 图3为温度对AgaB活力的影响。横坐标为温度，纵坐标为相对活力。
[0013] 图4为AgaB的温度稳定性。横坐标为时间，纵坐标为相对活力，3条曲线分别为 AgaB在40、45、50 °C下随时间变化的活力曲线。
[0014] 图5为薄层层析法分析AgaB的酶解产物。DP4:琼胶四糖；DP6:琼胶六糖；DP8:琼 胶八糖。
[0015] 图6为核磁共振法分析AgaB的酶解产物。A为3、6_内醚-a-L-半乳糖；B为 0 -D-半乳糖；r为还原端；nr为非还原端；a为a异头碳；0为0异头碳。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。
[0017] 为实现上述目的，本发明采用以下技术措施，其具体步骤是：
[0018] 1、琼胶酶菌株Flammeovirga sp.SJP92 的发酵
[0019] 挑取Flammeovirgasp.SJP92单菌落于2216E培养基中（成分为2 %氯化钠， 0. 3 %六水氯化镁，0. 6 %七水硫酸镁，0. 1 %硫酸铵，0. 02 %碳酸氢钠，0. 03 %二水氯化?丐， 0. 05 %氯化钾，0. 042 %磷酸二氢钾，0. 005 %溴化钠，0. 002 %六水氯化硒，0. 001 %柠檬酸 铵铁，0. 1%酵母粉和0. 5%蛋白胨，pH为7. 6)，32°C下200r/min培养12h，即为种子液。添 加1%的种子液于含〇.2%琼胶粉的2216￡培养基中（此培养基由2216￡液体培养基加入 〇.2%琼胶粉配制而成）中，32°(：下20(^/ 1^11发酵培养4211，即为发酵液。
[0020] 2、琼胶酶菌株Flammeovirgasp.SJP92发酵液的硫酸铵盐析
[0021] Flammeovirgasp.SJP92的发酵液13000r/min离心收集上清。在冰浴条件下， 往发酵液上清添加硫酸铵固体粉末至饱和度为40% (硫酸铵粉末添加过程中边添加边搅 拌）。硫酸铵粉末溶解完全后，4°C静置2h，13000r/min离心30min，收集上清，继续往发酵 液上清添加硫酸铵固体粉末至饱和度为80%。待硫酸铵粉末溶解完全后，4°C静置过夜， 13000r/min离心30min，收集沉淀。沉淀用少量20mM，pH值为7. 8的Tris?HC1缓冲液溶 解，并置于同样的缓冲液中透析，共透析3次，每次3h。透析后的酶液即为AgaB粗酶液。
[0022] 3、AgaB粗酶液经DEAE琼脂糖离子层析纯化
[0023] 去除DEAE琼脂糖离子填料的保存液，加入双蒸水，混匀成胶浆，静置至填料沉淀， 去除上清，以此方法用双蒸水漂洗填料5遍，完全去除填料的保存液。往填料中加入20mM， pH值为7. 8的Tris*HC1缓冲液，混匀成胶浆，重新静置至填料沉淀，去除上清，以此方法用 20mM，pH值为7. 8的Tris?HC1缓冲液平衡填料5遍，充分平衡DEAE琼脂糖离子填料。将 平衡好的DEAE琼脂糖离子填料加入AgaB粗酶液，颠倒混匀lh，3000r/min离心，取沉淀，沉 淀用少量的20mM，pH值为7. 8的Tris.HC1缓冲液混匀成胶浆装柱。用氯化钠浓度为0~ 〇. 3M的梯度洗脱液线性梯度洗脱，洗脱速度为1. 47mL/min，每管收集5mL。测定各管收集液 的琼胶酶活力，并绘制酶活曲线。根据酶活曲线，将具有琼胶酶活力的各管收集液合并，置 于3KDa超滤管中6000r/min离心浓缩，浓缩液即为AgaB的纯酶液。
[0024] 4、AgaB的酶学性质
[0025] 4. 1AgaB酶活力的测定
[0026] 取1yLAgaB的纯酶液与399yL溶于含有0.2 %琼脂糖的PBS(该溶液 购自上海生工，成分为磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，氯化钠，氯化钾，pH值为7.0)的 混合。将混合液在40 °C水浴30min，添加400yLDNS试剂（1、MillerGL.Useof dinitrosalicylicacidreagentfordeterminationofreducingsugar.Analytical chemistry. 195931:426-8)，沸水加热10min，在540nm波长下测定反应产物的吸光值。参 照半乳糖标准曲线计算还原糖产量，计算酶活。一个单位（U)的酶活定义为每分钟释放 lymol的还原糖所需要的酶量。实验重复三次取平均值。通过活力检测，AgaB的比活力为 1025.28U/mg〇
[0027] 4. 2AgaB的酶活染色分析
[0028] 将AgaB的纯酶液进行SDS-PAGE电泳，待电泳结束后，将凝胶放入到PBS中洗脱 30min，其间更换2次洗脱液，以去除SDS。将去除SDS的凝胶平铺在一块浓度为1.5%的琼 脂糖胶上，40°C下反应30min后，取下凝胶，向琼脂糖胶上滴加卢戈氏碘液（水溶液中含有 5% 12和10%KI)。若在SDS-PAGE凝胶上存在琼胶酶活性，则会在深褐色的琼脂糖胶上出 现透明的条带，反之则无。结果表明，所制备的内切型0琼胶酶AgaB具有琼胶酶活性（图 1)〇
[0029] 4. 3AgaB酶活pH的测定
[0030]分别用 20mM的NaAc?HAc缓冲液（pH值为 4. 5 ~5. 5)，Na2HP04?NaH2P04缓冲液 (pH值为6. 0~7. 5)，Tris?HC1缓冲液（pH值为8. 0~9. 0)代替反应体系中的PBS，在 40°C下测定各组的琼胶酶活力，结果表明AgaB在pH值为4. 5~9区间均有活性，pH值中 性区间是它活力较大的区间，且pH值为7. 0时，其活力最大（图2)。
[0031] 4. 4AgaB酶活温度的测定
[0032] 取1yLAgaB的纯酶液与399yL含有0. 2%琼脂糖的PBS混合，将反应体系分别 置于30~75 °C温度下测定各组的琼胶酶活力。结果表明AgaB在35~65 °C区间均有活性， 40-50°C是它活力较大的区间，其最适温度为40°C(图3)。
[0033] 4. 5AgaB温度稳定性的测定
[0034] 取1yLAgaB的纯酶液与399yL含有0. 2%琼脂糖的PBS混合，将反应体系分别 置于30~75°C温浴2. 5h，而后分别取样，测定活力。结果表明AgaB在最适温度40°C下最 为稳定，温浴150min后仍可以保持95 %以上的酶活。但在45°C和50°C下，活力则损失36 % 和 62% (图 4)。
[0035] 4.6金属离子与变性剂对AgaB活力的影响
[0036] 取1yLAgaB的纯酶液与399yL含有0.2%琼脂糖的PBS混合，分别在反应体系 中加入相应浓度的化学试剂，检测各组的琼胶酶活力。以不添加任何额外试剂的反应体系 为对照，计算酶活力变化的百分比。结果表明Ca2+、Mn2+、Zn2+、Co2+、Fe3+、Cu2+和NH4+对AgaB 的活力均有抑制作用，其中Zn2+，Fe3+和Cu2+几乎使AgaB失去了活性。其余的金属离子与 变性剂对AgaB没有明显的影响，金属离子与变性剂对AgaB活力的影响参见表1。
[0037] 表2金属离子与变性剂对AgaB活力的影响
[0038]
[0039] 4. 7AgaB的酶解产物分析：
[0040] 1)薄层层析法分析AgaB的酶解产物
[0041 ] 将AgaB的纯酶液按1 : 39的体积比加入到琼脂糖浓度为0? 3 % (w/v)的PBS中， 于40°C进行酶解反应，分别取不同时间（Omin、lmin、5min、10min、30min、lh、3h、12h)的反 应产物在硅胶板上点样，待样品完全干透，置于层析缸中展层，展层液成分为氯仿：甲醇： 冰乙酸=2 : 2 :l(v:v:V)，待前沿到达硅胶板顶端时取出硅胶板。冷风将硅胶板吹 干，喷显色剂（无水乙醇：浓硫酸=9 : 1)，冷风吹干，置于95°C烘箱显色lOmin。结果表 明，AgaB是一种内切酶，它降解的最终产物是6糖和4糖（图5)。
[0042] 2)核磁共振法分析AgaB的酶解产物
[0043] 将AgaB的纯酶液按1 : 39的体积比加入到15mL琼脂糖浓度为0. 3 % (w/v)的双 蒸水中，于40°C温浴酶解lh。待酶解完毕后，将酶解的寡糖溶液置于3KDa超滤管中6000r/ min离心过滤，收集滤出液冷冻干燥。将冻干粉末用0. 5mL氘代水溶解，于核磁共振谱仪进 行13C核磁共振，所得数据用MestReNova进行分析。结果表明，AgaB为0琼胶酶，其酶解 产物为新琼胶寡糖（图6)。结合薄层层析结果可知，AgaB为内切型的0琼胶酶，其酶解终 产物为新琼四糖和新琼六糖。
【主权项】
1.内切型P琼胶酶AgaB的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 琼胶酶菌株Flammeovirga sp. SJP92的发酵； 2) 琼胶酶菌株Flammeovirga sp.SJP92发酵液的硫酸铵盐析； 3. AgaB粗酶液经DEAE琼脂糖离子层析纯化； 所述Flammeovirga sp.SJP920-琼胶酶已于2014年11月27日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微 生物研究所，邮编：1〇〇1〇1，保藏中心登记入册编号：CGMCC No. 10071。
【专利摘要】内切型β琼胶酶AgaB的制备方法，涉及琼胶酶。1)琼胶酶菌株Flammeovirga？sp.SJP92的发酵；2)琼胶酶菌株Flammeovirga？sp.SJP92发酵液的硫酸铵盐析；3)AgaB粗酶液经DEAE琼脂糖离子层析纯化。通过琼胶酶菌株Flammeovirga？sp.SJP92的发酵，将发酵液经硫酸铵盐析以及DEAE琼脂糖离子层析等步骤纯化得到内切型β琼胶酶AgaB。纯化得到的这两种琼胶酶纯度高，活力好，为其实际应用提供了基础，同时，这两种琼胶酶纯化工艺的建立也为其工业化应用奠定了基础。CGMCC No.1007120141127
【IPC分类】C12N9/42
【公开号】CN105062994
【申请号】CN201510609318
【发明人】阮灵伟, 黄能平, 施泓, 徐洵
【申请人】国家海洋局第三海洋研究所
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年9月23日