一种获取西兰花毛状根的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种毛状根的获取方法，尤其涉及一种获取西兰花毛状根的方法。
【背景技术】
[0002]西兰花中含有丰富的抗癌物质萝卜硫素，被美国《时代周刊》评为十大最佳营养蔬菜之一。西兰花可以增强机体免疫力、促进生长、增强血管韧性等功效，可以预防患乳腺癌、胃癌等癌症的风险。
[0003]西兰花中的次生代谢产物萝卜硫素由于具有防癌、抗癌的功效，在医学上有着重要的应用价值。而目前通常是从西兰花种子或西兰花幼苗中获取，由于其种子原料成本过高，西兰花的育种方式复杂且周期长，并且西兰花种子与幼苗中的萝卜硫素含量低，无法满足日常生活中人们对萝卜硫素的需求。此外传统的种植技术对植物的产量和质量都有较大的影响，不利于产业化生产。若建立西兰花毛状根的诱导及培养体系，通过培养大量的毛状根来提高萝卜硫素的产量将是一种应用于工业化中简单、快速的方法。
[0004]虽然在个别植物中已经实现了通过发根农杆菌介导植物外植体而获得毛状根，如烟草、新疆雪莲等，并且获得的这些毛状根具有自主生长、多根毛等特点，但到目前为止，国内外还未见利用发根农杆菌Ri质粒介导西兰花毛状根培养体系的报道。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种简单、高效的获取西兰花毛状根的方法。
[0006]为解决上述问题，本发明所述的一种获取西兰花毛状根的方法，包括以下步骤: ⑴在超净工作台上，用高温灭菌后的剪刀剪取同一批快繁的西兰花无菌苗外植体，放在无菌滤纸上，然后用灭菌的针头在其表面扎2~8个伤口，并接种于MS培养基中，最后于25°C暗处预培养2~7d，得到预培养的无菌苗外植体；
⑵将所述预培养的无菌苗外植体用0D_为0.2-0.8的发根农杆菌在25 °C侵染2~10min，然后用无菌滤纸吸干其表面残留的菌液，并接种于添加浓度为50~200 ymol/L乙酰丁香酮的MS培养基上，于25°C暗处共培养2~8d，得到共培养后的受体外植体；
⑶所述共培养后的受体外植体转接于添加浓度为80~300mg/L羧苄青霉素二钠的MS培养基中，于25°C暗培养，每5d转接一次，经2~5次转接后即可获得无菌毛状根。
[0007]所述步骤⑴中剪取的西兰花无菌苗外植体为0.5cm2的叶片和0.5cm长的茎段。
[0008]所述步骤⑵中发根农杆菌的型号为ATCC11325、R1601、ATCC15834中的任意一种。
[0009]所述MS培养基的pH值均为5.8。
[0010]本发明与现有技术相比具有以下优点:
1、本发明在国内外未有类似报道，在获取毛状根时侵染时间短，诱导率高(40.34%~73.64%)，且其浸染所得毛状根中次生代谢产物萝卜硫素含量(可达3689.35 μ g/g)较西兰花种子、叶片等组织高30~200倍，具有较好的市场开发前景。
[0011]2、本发明投资少，工艺简单，适合工厂化生产。
【具体实施方式】
[0012]实施例1 一种获取西兰花毛状根的方法，包括以下步骤:
⑴在超净工作台上，用高温灭菌后的剪刀剪取同一批快繁的西兰花无菌苗外植体，放在无菌滤纸上，然后用灭菌的针头在其表面扎2个伤口，并接种于pH值为5.8的MS培养基中，最后于25°C暗处预培养2d，得到预培养的无菌苗外植体。
[0013]其中:剪取的西兰花无菌苗外植体为0.5cm2的叶片和0.5cm长的茎段。
[0014]⑵将预培养的无菌苗外植体用OD6。。为0.2的发根农杆菌在25°C侵染2min，然后用无菌滤纸吸干其表面残留的菌液，并接种于添加浓度为50 μ mol/L乙酰丁香酮且pH值为5.8的MS培养基上，于25°C暗处共培养2d，得到共培养后的受体外植体。
[0015]其中:发根农杆菌的型号为ATCC11325。
[0016]⑶共培养后的受体外植体转接于添加浓度为80mg/L羧苄青霉素二钠且pH值为5.8的MS培养基中，于25°C暗培养，每5d转接一次，经2次转接后即可获得无菌毛状根。毛状根诱导率可达52.56%ο
[0017]实施例2 —种获取西兰花毛状根的方法，包括以下步骤:
⑴在超净工作台上，用高温灭菌后的剪刀剪取同一批快繁的西兰花无菌苗外植体，放在无菌滤纸上，然后用灭菌的针头在其表面扎5个伤口，并接种于pH值为5.8的MS培养基中，最后于25°C暗处预培养5d，得到预培养的无菌苗外植体。
[0018]其中:剪取的西兰花无菌苗外植体为0.5cm2的叶片和0.5cm长的茎段。
[0019]⑵将预培养的无菌苗外植体用OD6。。为0.6的发根农杆菌在25°C侵染6min，然后用无菌滤纸吸干其表面残留的菌液，并接种于添加浓度为150ymol/L乙酰丁香酮且pH值为5.8的MS培养基上，于25 °C暗处共培养5d，得到共培养后的受体外植体。
[0020]其中:发根农杆菌的型号为ATCC15834。
[0021]⑶共培养后的受体外植体转接于添加浓度为150mg/L羧苄青霉素二钠且pH值为5.8的MS培养基中，于25 °C暗培养，每5d转接一次，经4次转接后即可获得无菌毛状根。毛状根诱导率可达73.64%ο
[0022]实施例3 —种获取西兰花毛状根的方法，包括以下步骤:
⑴在超净工作台上，用高温灭菌后的剪刀剪取同一批快繁的西兰花无菌苗外植体，放在无菌滤纸上，然后用灭菌的针头在其表面扎8个伤口，并接种于pH值为5.8的MS培养基中，最后于25°C暗处预培养7d，得到预培养的无菌苗外植体。
[0023]其中:剪取的西兰花无菌苗外植体为0.5cm2的叶片和0.5cm长的茎段。
[0024]⑵将预培养的无菌苗外植体用OD6。。为0.8的发根农杆菌在25°C侵染lOmin，然后用无菌滤纸吸干其表面残留的菌液，并接种于添加浓度为200 μ mol/L乙酰丁香酮且pH值为5.8的MS培养基上，于25 °C暗处共培养8d，得到共培养后的受体外植体。
[0025]其中:发根农杆菌的型号为R1601。
[0026]⑶共培养后的受体外植体转接于添加浓度为300mg/L羧苄青霉素二钠且pH值为
5.8的MS培养基中，于25°C暗培养，每5d转接一次，经5次转接后即可获得无菌毛状根。毛状根诱导率为40.34%ο
【主权项】
1.一种获取西兰花毛状根的方法，包括以下步骤: ⑴在超净工作台上，用高温灭菌后的剪刀剪取同一批快繁的西兰花无菌苗外植体，放在无菌滤纸上，然后用灭菌的针头在其表面扎2~8个伤口，并接种于MS培养基中，最后于25°C暗处预培养2~7d，得到预培养的无菌苗外植体； ⑵将所述预培养的无菌苗外植体用0D_为0.2-0.8的发根农杆菌在25 °C侵染2~10min，然后用无菌滤纸吸干其表面残留的菌液，并接种于添加浓度为50~200 ymol/L乙酰丁香酮的MS培养基上，于25°C暗处共培养2~8d，得到共培养后的受体外植体； ⑶所述共培养后的受体外植体转接于添加浓度为80~300mg/L羧苄青霉素二钠的MS培养基中，于25°C暗培养，每5d转接一次，经2~5次转接后即可获得无菌毛状根。2.如权利要求1所述的一种获取西兰花毛状根的方法，其特征在于:所述步骤⑴中剪取的西兰花无菌苗外植体为0.5cm2的叶片和0.5cm长的茎段。3.如权利要求1所述的一种获取西兰花毛状根的方法，其特征在于:所述步骤⑵中发根农杆菌的型号为ATCCl 1325、R160UATCC15834中的任意一种。4.如权利要求1所述的一种获取西兰花毛状根的方法，其特征在于:所述MS培养基的pH值均为5.8。
【专利摘要】本发明涉及一种获取西兰花毛状根的方法，该方法包括以下步骤：⑴剪取同一批快繁的西兰花无菌苗外植体，放在无菌滤纸上，然后用灭菌的针头在其表面扎2~8个伤口，并接种于MS培养基中，最后于暗处预培养，得到预培养的无菌苗外植体；⑵将所述预培养的无菌苗外植体用发根农杆菌侵染，然后用无菌滤纸吸干其表面残留的菌液，并接种于添加乙酰丁香酮的MS培养基上，于暗处共培养，得到共培养后的受体外植体；⑶所述共培养后的受体外植体转接于添加羧苄青霉素二钠的MS培养基中，于暗培养，每5d转接一次，经2~5次转接后即可获得无菌毛状根。本发明简单、高效，适合工厂化生产。
【IPC分类】C12N15/82, C12N5/10
【公开号】CN105063084
【申请号】CN201510554153
【发明人】马绍英, 李胜, 胡翠珍, 赵生琴
【申请人】甘肃农业大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年9月2日