小反刍兽疫病毒ch/gddg/2014株全基因组序列及其扩增引物对的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明专利属于分子生物学领域，涉及小反刍兽疫基因型4型全基因组序列测定 方法，具体的涉及小反刍兽疫病毒CH/GDDG/2014株全基因组序列测定方法。
【背景技术】
[0002] 小反刍兽疫是严重危害山羊、绵羊、野生反刍动物等动物健康的烈性传染病，可引 起感染动物的肺炎、腹泻、口炎、流产等多种临床症状，世界动物卫生组织将其列为A类动 物疫病。小反刍兽疫有4个基因型，不同基因型或同一基因型毒株的基因组间存在较大的 差异。2007年和2013年，在我国的西藏和新疆暴发了两波小反刍兽疫疫情，尤其是第二波 疫情，波及20多个省市自治区，给我国养羊业及野生反刍动物带来了巨大的经济损失。研 究表明新型基因4型小反刍兽疫病毒是罪魁祸首。尽管我国养殖场已经开始使用小反刍兽 疫疫苗（基因2型），但仍有野生型病毒暴发流行。目前，虽有新型基因4型小反刍兽疫病 毒的全基因组序列报道，但是没有公开显示其如何扩增获得，这不利于我国构建新型小反 刍兽疫的反向遗传系统，同时，进一步会影响我们了解该病毒的生长曲线、病毒滴度以及致 病性等生物学特征。
[0003] 基于以上问题，公开一种有效、简单、准确的新型基因4型小反刍兽疫病毒的全基 因组序列测定方法很有必要。
【发明内容】
[0004] 本专利的目的在于运用分子生物学、生物信息学等方法进行引物设计、序列比对 及反应体系优化，提供新型基因4型小反刍兽疫病毒CH/GDDG/2014株的全基因组序列及其 扩增引物对。
[0005] 本发明提供的小反刍兽疫病毒CH/⑶DG/2014株全基因组序列，其序列如SEQ ID No. 1所示。
[0006] 本发明还提供用于扩增小反刍兽疫病毒CH/⑶DG/2014株全基因组序列的引物， 包括如SEQ ID No. 2~23所示的引物。
[0007] 本发明还提供一种扩增小反刍兽疫病毒CH/⑶DG/2014株全基因组的方法，包括 以下步骤：
[0008] (1)提取小反刍兽疫病毒CH/⑶DG/2014株的RNA ;
[0009] (2)用SEQ ID No. 2~23所示的引物对小反刍兽疫病毒全基因组序列进行分段一 步法RT-PCR扩增；
[0010] (3)目的片段的回收、连接、转化、阳性菌的鉴定及测序；
[0011] (4)利用DNAStar等生物信息学软件对所测定的序列进行比对分析、序列拼接，将 11个片段首尾相连，得到小反刍兽疫病毒CH/GDDG/2014株全基因组序列。
[0012]其中，所述的50yL-步法RT-PCR反应体系包括：2XBuffer 25yL，每段扩增上 下游引物各lyL，MixlyL，病毒RNA5yL，灭菌ddH20 17mL;
[0013] 其中，所述的一步法RT-PCR反应程序包括：50°C反转录30min，95°C预变性5min， 35 个循环（95°C变性 30s，53°C~60°C退火 30s，72°C延伸 50s~188s)，72°C再延伸lOmin。
[0014] 本发明将病毒基因组序列分为11个片段，用一步法RT-PCR方法扩增相应的cDNA， 将扩增的PCR片段克隆到pGM-T载体上进行核酸测序。本发明可以有效地扩增出目的片 段，提供了全基因组序列，有利于研究小反刍兽疫病毒的遗传学、分子流行病学及反向遗传 学研究等。
[0015] 本发明分离鉴定的小反刍兽疫病毒CH/⑶DG/2014株属于基因4型小反刍兽疫病 毒毒株，涉及的山羊样本保存于广东省农业科学院动物卫生研究所动物疫病诊断中心，地 址：广州市天河区五山路白石岗街诊断中心1号楼，保存样品编号为⑶DG。
【附图说明】
[0016] 图1所示为扩增小反刍兽疫病毒CH/⑶DG/2014株基因片段1~11的琼脂糖凝胶 电泳图片。M :DNA Marker 2000 ;1~11表示扩增的11个大小不同的DNA片段。
[0017] 图2所示为小反刍兽疫病毒各基因型的遗传进化树。标注"鲁"的毒株是小反刍 兽疫病毒CH/⑶DG/2014株；标注" "的毒株是小反刍兽疫疫苗毒株。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，其操作步骤会进一步明确。
[0019] 优化实施例：
[0020] (1)病毒RNA抽提
[0021] 取经过RT-PCR鉴定为小反刍兽疫病毒阳性的山羊肺脏样本，进行研磨、组织匀 浆，1 : 2进行稀释，反复冻融3次，按照病毒RNA提取试剂盒（Axygen公司）进行RNA抽 提，最后，用50~100yLRNase-free双蒸水进行RNA洗脱，保存于-20°C冰箱；
[0022] (2)引物设计与合成
[0023] 通过小反会兽疫病毒多个基因型全基因组序列的比对，应用PrimerPremier5. 0 软件，选取保守的序列作为引物，相邻的扩增片段之间有长短不一的重叠序列，便于后期的 序列拼接。共涉及11对22条引物（苏州金唯智生物科技有限公司化学合成），将小反刍 兽疫病毒的全基因组序列分为11段，具体引物序列及对应位点如表1所示。"F"代表正向 引物，"R"代表反向引物。引物位置参考China/XJYL/2013株（GenBank登录号：KM091959) 基因组。
[0024] 表1引物信息
[0025]
[0026] (3)各个基因片段的一步法RT-PCR扩增
[0027] 将全基因组分为11个片段分别扩增，引物如SEQIDNo. 2~23所示。第1段和第 11个片段分别为基因组的5'末端和3'末端，在进行PCR的同时，我们也采用了 5'末端和 3'末端RACE处理，以获得其最真实5'末端和3'末端基因组序列。一步法RT-PCR扩增反 应体系（50yL)包括：2XBuffer25yL，每段扩增上下游引物各lyL，MixlyL，病毒RNA 5 11]^，灭菌(1(11120 17mL。
[0028]PCR反应程序包括：50°C反转录30min，95°C预变性5min，35个循环（95°C变性 30s，53°C~60°C退火30s，72°C延伸50s~188s)，72°C再延伸lOmin。其中，第1段退火温 度为60°C，第2段退火温度为53°C，第4段退火温度为57°C，其他片段退火温度为55°C，而 第1段延伸温度为51s，第2段延伸温度为66s，第3段延伸温度为60s，第4段延伸温度为 50s，第5段延伸温度为66s，第6段延伸温度为174s，第7段和第8段延伸温度为188s，第 9段、第10段和第11段延伸温度为120s。
[0029] (4)目的基因片段的回收
[0030] PCR胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，具体回收方法如下：
[0031] ①.柱平衡步骤：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500y1的平衡 液BL，12,OOOrpm(~13,400Xg)离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回 收集管中。②.估计PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀（无 需去除石蜡油或矿物油）。③.将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入收 集管中），室温放置2min，12,OOOrpm(~13, 400Xg)离心3〇-6〇sec，倒掉收集管中的废液， 将吸附柱CB2放入收集管中。④.向吸附柱CB2中加入600y1漂洗液PW，12,OOOrpm(~ 13,400Xg)离心3〇-6〇sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。⑤.重复 操作步骤④。⑥.将吸附柱CB2放回收集管中，12,000印111(~13,400\8)离心21^11，尽 量除去漂洗液。将吸附柱CB2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响 下一步的实验。⑦.将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加 30-50y1洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12,OOOrpm(~13, 400Xg)离心2min收集DNA 溶液。
[0032] (5)将目的基因片段连接到pGM-T载体上：
[0033] 具体操作方法如下：在0.2mlPCR管中加入目的DNA3yl，10XT4DNA连接酶 1yl，pGM-T克隆载体1yl，ddH20 5y1，轻轻混勾，于22°C连接l-2h。反应结束后，将管置 于冰上冷却。
[0034] (6)连接产物的转化
[0035] 取5^1连接产物加到50-100 ^11'0?10感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30111111;然 后将离心管置于42°C水浴90sec，取出管后立即置于冰浴中放置2-3min，其间不要摇动离 心管；向离心管中加入250-500 1^37°(：预热的1^(不含抗生素）培养基，150印111，37°(：振 荡培养lh。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏；将离心管中的菌液混 勾，吸取100yL加到含氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻棒 轻轻地将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37°C培养12-16h;将得到的白色菌 落接种到4mLLB液体培养基中，37°C摇床振荡培养12-16h，保存菌种后，待质粒提取。
[0036] (7)阳性质粒的鉴定
[0037] 取少许质粒进行PCR扩增，见⑶描述。
[0038] (8)序列测定
[0039] 对鉴定为阳性的质粒，送北京六合华大基因科技股份有限公司广州测序部进行测 序。
[0040] (9)序列拼接
[0041] 使用DNAStar软件中的SeqMan程序，将11个片段的测序结果进行序列拼接、编辑 及校正。同时，结合测序峰图对不同批次的测序结果进行碱基校对，最终获得小反刍兽疫病 毒CH/⑶DG/2014株全基因组序列（15,954bp)，如SEQIDNo. 1所示。
【主权项】
1. 一种测定小反刍兽疫病毒全基因组的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 提取小反刍兽疫病毒的RNA ; (2) 配置50 y L PCR反应体系，用引物对小反刍兽疫病毒全基因组序列进行分段一步 法RT-PCR扩增； (3) 目的片段的回收、连接、转化、阳性菌的鉴定及测序； (4) 利用DNAStar等生物信息学软件对所测定的序列进行比对分析、序列拼接，得到小 反刍兽疫病毒全基因组序列。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：50y L-步法RT-PCR反应体系包括： 2XBuffer 25yL，每段扩增上下游引物各lyL，Mix lyL，病毒RNA 5yL，灭菌CldH2O 17mL〇3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于：PCR反应程序包括：50°C反转录30min，95°C 预变性 5min，35 个循环（95°C变性 30s，53°C ~60°C 退火 30s，72°C延仲 50s ~188s)，72°C 再延伸lOmin。4. 一种小反刍兽疫病毒全基因组序列，所述小反刍兽疫病毒为CH/GDDG/2014株，所述 序列如SEQ ID No. 1所示。5. -种用于扩增小反刍兽疫病毒全基因组序列的引物，所述引物序列如SEQ ID No. 2~23所示。
【专利摘要】本发明公开了小反刍兽疫病毒CH/GDDG/2014株全基因组序列及其扩增引物对。本发明将病毒基因组序列分为11个片段，用一步法RT-PCR方法扩增相应的cDNA，将扩增的PCR片段克隆到pGM-T载体上进行核酸测序。本发明可以有效地扩增出目的片段，提供了全基因组序列，有利于研究小反刍兽疫病毒的遗传学、分子流行病学及反向遗传学研究等。
【IPC分类】C12Q1/70, C12N15/40, C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105112561
【申请号】CN201510500411
【发明人】翟少伦, 魏文康, 吕殿红, 温肖会
【申请人】广东省农业科学院动物卫生研究所
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年8月14日