一种提取富集抗菌肽粗品的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品安全领域，尤其是将植物提取物作为抗菌剂使用时的抗菌剂的快 速分离、富集的方法。
【背景技术】
[0002] 抗生素在广泛用于预防和治疗微生物感染的疾病上发挥了重要的作用。然而不合 理的使用抗生素导致随后出现的多重耐药菌以及耐药菌感染引发的死亡等问题已成为世 界范围内公共卫生难题，为此迫切需要安全高效的新型抗生素。抗菌肽属于抗生素的一个 新家族，它们具有广谱的抗菌活性，不但可以作用于细菌、真菌甚至对病毒、癌细胞也有抑 制作用。抗菌肽特异性作用于病源微生物或外来侵害但对宿主无毒性或毒性小，对抗菌肽 的大量研究表明抗菌肽有望成为新型安全、高效的抗菌药物。抗菌肽的分子量较小、溶解性 好、抗菌谱广、抗菌活性强、选择性好等特点使其具有开发和应用价值。目前抗菌肽主要用 于医药行业辅助或代替部分抗生素进行抗菌治疗，作为防腐剂用于食品和化妆品工业，利 用基因工程技术将抗菌肽基因转入农作物和畜禽用于防治病虫害，因此抗菌肽具有大的应 用潜力。 文献报道用于肽提取的膜分离系统，由于分离精度较高，通常在1KD~10KD范围，在这 个过滤精度，通常使用有机膜，由于在水解或者酶解过程中，还残留有大量未被完全被分解 的蛋白，在膜过滤过程中，由于使用的有机膜通常带有电负性，会导致蛋白很容易附着在膜 表面，从而造成膜污染，导致膜的过滤效率和过滤效果大幅下降；由于有机材质不能耐受高 浓度的酸、碱、氧化剂和高温等清洗条件，因而有机膜不容易清洗再生。
[0003] 本发明使用1KD~200KD过滤精度范围的无机膜作为分离手段，由于无机膜使用 三氧化二铝、二氧化钛、氧化锆等无机材质烧结形成过滤层，可以有效的避免蛋白在膜表面 的吸附，可以长时间稳定运行，鉴于无机材质具有很高的化学稳定性，可以使用高温、高浓 度酸、碱及氧化剂进行清洗再生，从而保证膜分离的性能长期保持稳定。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种高效、快捷的抗菌肽提取 方法。
[0005] 本发明采用了以下技术方案实现本发明目的： A、 原料的预处理：直接使用荞麦、大豆等杂粮作为原料时，需要先按常规方法进行脱脂 处理，然后进行粉碎；使用大豆、油菜等油料作物的柏作为原料时，直接将原料粉碎，得到原 料粉末； B、 酶解：将步骤A预处理后原料中加入一定量的水，调节固形物含量2%~15% (w/v)，调 节pH为2. 0~9. 0,在温度25~80°C下加入生物酶进行酶解0. 5~20h，酶量为500~50000U/g， 得到酶解液； C、 酶解液预过滤：将步骤B所得的酶解液使用滤布或者滤袋进行预过滤，去除酶解液 中的大部分悬浮物，得到清液； D、 去除大分子杂质：将步骤C所得的清液使用大孔径无机超滤膜进行过滤，去除清液 中残留的悬浮物和未能水解的蛋白等大分子杂质，富含肽的滤液； E、 脱盐浓缩：将步骤D的富含肽的滤液使用小孔径无机膜超滤进行过滤，去除其中的 小分子肽和无机盐分等杂质，滤液浓缩，浓缩倍数控制在5~20倍，得到高浓度的抗菌肽粗 品。
[0006] 所述的生物酶为纤维素酶、风味蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木 瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等酶的一种或多种的混合物。
[0007] 所述的步骤C的预过滤装置过滤精度为5~100微米。
[0008] 所述的步骤D中大孔径无机超滤膜的过滤精度为截留分子量20000道尔顿~20万 道尔顿 所述步骤E中的小孔径无机超滤膜的过滤精度为截留分子量1000道尔顿~20000道尔 顿。
[0009] 本发明的优点和技术效果如下： 1、 使用无机膜对酶解后的原料进行预处理，可以大幅度提高后续色谱等提纯设备的工 作效率和使用周期； 2、 无机膜设备操作简单、设备使用寿命长、清洗及维护成本低，满足工业化大规模生产 的需求； 3、 使用的高精度无机膜在国内相关领域的应用较少，特别是在抗菌肽提取领域未见文 献报道； 4、 相对于有机超滤膜，无极膜对于酸、碱、氧化剂等膜设备常用药剂的耐受范围更广， 对于操作者的技能要求低，适合工厂推广使用。
【具体实施方式】
[0010] 下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内 容。
[0011] 实施例1 :本提取富集抗菌妝粗品的方法，具体内容如下： 将荞麦按常规方法脱脂后粉碎，加入纯水，调节固形物含量为10%，调节pH为9. 0,按每 克原料添加2000U酶的比例，在60°C下加入碱性蛋白酶，酶解5小时，得酶解液；使用50微 米的滤袋对酶解液进行过滤，得到清液；清液使用过滤精度10KD的陶瓷膜(上海凯鑫分离 技术有限公司)进行浓缩、过滤，过滤压力为〇. 3Mpa，操作温度25°C，过滤后使用3倍滤液体 积的纯水进行透洗，收集合并滤液，即为富含肽的滤液；使用过滤精度5KD的陶瓷膜对富含 肽的滤液再次进行浓缩、过滤，操作压力〇. 3MPa，操作温度25°C，过滤结束使用3倍滤液体 积的纯水进行透洗，收集合并滤液，滤液即得到高浓度的抗菌肽粗品。
[0012] 实施例2 :本提取富集抗菌肽粗品的方法，具体内容如下： 将大豆豆柏粉碎作为原料，加入纯水，调节固形物含量为10%，调节PH7. 0,按每克原料 添加3000U酶的比例，在50°C下加入中性蛋白酶，酶解6小时，得酶解液；使用20微米的滤 袋对酶解液进行过滤，得到清液；清液使用过滤精度100KD的陶瓷膜(上海凯鑫分离技术有 限公司)进行浓缩、过滤，过滤压力0.1 Mpa，操作温度30°C，过滤后使用3倍滤液体积的纯水 进行透洗，收集合并滤液，即为富含肽的滤液；使用过滤精度10KD的陶瓷膜再次对富含肽 的滤液进行浓缩、过滤，操作压力0. 3MPa，操作温度30°C，过滤结束用2倍滤液体积的纯水 进行透洗，收集合并滤液，滤液即得到高浓度的抗菌肽粗品。
[0013] 实施例3 :本提取富集抗菌肽粗品的方法，具体内容如下： 将大豆豆柏粉碎作为原料，加入纯水，调节固形物含量为10%，调节PH7. 5,按每克原料 添加5000U酶的比例，在45°C下加入胰蛋白酶，酶解5小时，得酶解液；使用20微米的滤袋 对酶解液进行过滤，得到清液；清液使用过滤精度10KD的陶瓷膜(上海凯鑫分离技术有限 公司）进行过滤，操作温度40°C，收集滤液，即为富含肽的滤液；使用过滤精度1KD的陶瓷 膜再次对富含肽的滤液进行过滤，操作温度30°C，收集滤液，滤液即得到高浓度的抗菌肽粗 品。
[0014] 实施例4 :本提取富集抗菌妝粗品的方法，具体内容如下： 将荞麦按常规方法脱脂后粉碎，加入纯水，调节固形物含量为10%，调节pH为6. 5,按每 克原料添加10000U酶的比例，在50°C下加入木瓜蛋白酶酶和风味蛋白酶等质量混合酶，酶 解5小时，得酶解液；使用50微米的滤袋对酶解液进行过滤，得到清液；清液使用过滤精度 50KD的陶瓷膜(上海凯鑫分离技术有限公司)进行过滤，收集滤液，即为富含肽的滤液；使用 过滤精度5KD的陶瓷膜对富含肽的滤液再次进行过滤，收集滤液，滤液即得到高浓度的抗 囷妝粗品。
[0015] 杂粮酶解液抑菌率分析时将100微升经0. 22微米微孔滤膜过滤除菌的酶解液加 入96孔酶标板中，再加入等体积的1. 0 X 106 CFU/mL的大肠杆菌ATCC25922菌悬液作为试 验组，用100微升无菌生理盐水代替等体积的酶解液作为对照组，37°C培养12 h后用酶标 仪测定620nm下吸光值，酶解液的抑菌率为对照组和实验组吸光值之差与对照组吸光值的 比值(见表1)。
[0016] 表1 :杂粮酶解液抑菌率统计
【主权项】
1. 一种提取富集抗菌肽粗品的方法，其特征在于，以杂粮为原料，使用以下步骤分离提 纯抗菌肽： A、 原料的预处理 将杂粮脱脂后粉碎，或直接将油料作物榨油后得到的柏粉碎后作为原料； B、 酶解 在步骤A预处理后的原料加水，调节固形物含量为2%~15%，调节pH至2. 0~9. 0,在 温度25~80°C下加入生物酶进行酶解0. 5~20h，得酶解液，其中酶添加量为每克原料添加 500~50000U 酶； C、酶解液预处理 将步骤B的酶解液进行预过滤，得到清液； D、 除大分子杂质 将步骤C的清液使用大孔径无机超滤膜进行过滤，得富含肽的滤液； E、 去小分子杂质及浓缩 将步骤D的滤液使用小孔径无机超滤膜进行过滤，滤液即为高浓度的抗菌肽粗品。2. 根据权利要求书1所述的提取富集抗菌肽粗品的方法，其特征在于：生物酶为纤维 素酶、风味蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶 中一种或几种混合物。3. 根据权利要求书1或2所述的提取富集抗菌肽粗品的方法，其特征在于：步骤C中 的预过滤的过滤精度为5~100微米。4. 根据权利要求书1所述的提取富集抗菌肽粗品的方法，其特征在于：步骤D中的大 孔径无机超滤膜的过滤精度为截留分子量20000道尔顿~20万道尔顿。5. 根据权利要求书1所述的提取富集抗菌肽粗品的方法，其特征在于：步骤E中的小 孔径无机超滤膜的过滤精度为截留分子量1000道尔顿~1〇〇〇〇道尔顿。
【专利摘要】本发明公开了一种从杂粮中快速粗提取富集抗菌肽粗品的方法，是以荞麦、大豆等杂粮作为原料，将荞麦、大豆等杂粮脱脂后粉碎，在粉末中加入水和生物酶，调节温度和pH进行酶解，使用滤布或者滤袋去除料液中的大部分悬浮物，使用大分子量无机膜对滤液进行澄清过滤，使用小分子量的无机膜对清夜进行浓缩、脱盐，得到高浓度的肽粗品；本发明使用无机膜对酶解液进行分离、浓缩，可以快速、高效的富集、生产抗菌肽。
【IPC分类】C07K1/34, C12P21/06
【公开号】CN105132505
【申请号】CN201510621744
【发明人】李莉蓉, 陈旋, 梁小波, 韩鹏
【申请人】昆明理工大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年9月28日